V oblasti molekulárnej diagnostiky je polymerázová reťazová reakcia (PCR) dlho považovaná za zlatý štandard na detekciu nukleových kyselín. V posledných rokoch si technológie izotermickej amplifikácie, reprezentované rekombinázovou polymerázovou amplifikáciou (RPA), získali čoraz väčšiu pozornosť vďaka svojej rýchlosti, jednoduchosti a vhodnosti na-testovanie na mieste.
Hoci PCR aj RPA sú metódy amplifikácie nukleových kyselín, výrazne sa líšia v princípoch fungovania, požiadavkách na vybavenie a aplikačných scenároch, vďaka čomu je každá technológia vhodná pre rôzne diagnostické potreby.
1. Základné princípy: tepelné cyklovanie vs. konštantné{2}}zosilnenie teploty
PCR je biochemický proces schopný amplifikovať jednu molekulu DNA do miliónov kópií v krátkom časovom období. Reakcia je založená na opakovanom tepelnom cykle a pozostáva z troch hlavných krokov:
1. Denaturácia (90–95 stupňov) – Dvojvláknová- DNA sa rozdelí na jednotlivé vlákna.
2. Žíhanie (55–65 stupňov) – Priméry sa viažu na cieľové sekvencie.
3. Predĺženie (72 stupňov) – DNA polymeráza syntetizuje nové vlákna DNA.
Prostredníctvom týchto teplotne{0}}riadených cyklov sa cieľová DNA amplifikuje exponenciálne s vysokou presnosťou. PCR však vyžaduje komplexné nástroje tepelného cyklovania a zvyčajne trvá 1–2 hodiny.
Na rozdiel od toho RPA pracuje pri konštantnej teplote 37–42 stupňov, čo umožňuje rýchlu amplifikáciu nukleových kyselín bez tepelných cyklov. Táto technológia sa spolieha na koordinované pôsobenie rekombinázových proteínov, jednovláknových DNA{4}}väzbových proteínov a reťazcovej- vytesňujúcej DNA polymerázy na dosiahnutie vysoko špecifickej cieľovej amplifikácie za izotermických podmienok.
DNA polymeráza použitá v RPA má aktivitu vytesňovania vlákna, ale chýba jej 5'→3' exonukleázová aktivita. Počas amplifikácie sa vonkajšie priméry rozširujú pozdĺž templátového vlákna. Keď sa stretnú s dvojvláknovými oblasťami syntetizovanými z vnútorných primérov, polymeráza nemôže degradovať downstream vlákno a namiesto toho ho vytesňuje, čím vznikajú nové amplifikačné produkty.
Celá reakcia je dokončená pri konštantnej teplote, čím sa eliminuje potreba zložitého prístrojového vybavenia a umožňuje sa skutočné testovanie-v{1}}starostlivosti a terénnom-testovaní. Začlenením reverznej transkriptázy možno RPA použiť aj na detekciu cieľa RNA.
Výsledky amplifikácie možno analyzovať pomocou viacerých formátov odčítania vrátane detekcie koncových bodov,{0}}monitorovania fluorescencie v reálnom čase, testov laterálneho prietoku a možno ich ďalej integrovať so systémami CRISPR-Cas, mikrofluidikou alebo sekvenovaním ďalšej{2}}generácie (NGS) pre pokročilý vývoj testov.
Aplikačné scenáre: Laboratórna presnosť vs. rýchle testovanie-na mieste
PCR sa stala jednou z najcennejších molekulárnych diagnostických technológií a zostáva zlatým štandardom pre testovanie nukleových kyselín.
Vďaka svojej vysokej presnosti, nákladovej{0}}efektívnosti a škálovateľnosti sa PCR široko používa v klinickej diagnostike, centralizovaných laboratóriách, výskumných inštitúciách a rozsiahlych{1}}skríningových programoch, kde je ľahko dostupná infraštruktúra a vyškolený personál.
RPA na druhej strane ponúka jasné výhody v rýchlej{0}}diagnostike na mieste. So zosilnením dokončeným už za 20 minút, minimálnymi požiadavkami na vybavenie a jednoduchou obsluhou sa RPA ideálne hodí.
- Primárna zdravotná starostlivosť a núdzové nastavenia
- Colná a hraničná kontrola
- Terénny skríning chorôb zvierat a rastlín
- Testovanie bezpečnosti potravín a životného prostredia
V kombinácii s prenosnými zariadeniami a laterálnymi prietokovými prúžkami umožňuje RPA rýchle a spoľahlivé molekulárne testovanie mimo tradičných laboratórií.
MIRA (multienzýmová izotermická rýchla amplifikácia)je patentovaná technológia izotermického zosilnenia Amp Future. Patrí do rovnakej technickej rodiny ako RPA a je inšpirovaný prirodzenou rekombináciou a opravnými mechanizmami DNA, využívajúcimi viaceré funkčné enzýmy na dosiahnutie rýchlej amplifikácie nukleových kyselín pri konštantnej teplote.
MIRA využíva koordinovaný systém piatich kľúčových enzýmov vrátane helikázy, rekombinázy, jednovláknového proteínu viažuceho DNA- a DNA polymerázy, ktoré umožňujú:
- Široký rozsah prevádzkových teplôt: 25 stupňov – 45 stupňov
- Rýchle zosilnenie: výsledky do 20 minút
- Vysoká citlivosť a špecifickosť
- Zvýšená bezpečnosť a znížené riziko kontaminácie
MIRA je technológia amplifikácie nukleovej kyseliny špeciálne navrhnutá pre skutočné testovanie na-mieste a mieste-v-starostlivosti.
Na základe platformy MIRA vyvinul Amp Future komplexné portfólio produktov pre rýchly molekulárny POCT, vrátane:
Činidlo na rýchle uvoľňovanie nukleových kyselín:
Amplifikovateľná nukleová kyselina sa získa do 5 minút pri teplote miestnosti; nízka inhibícia umožňujúca plné naplnenie vzorky až do 50 μl; preprava a skladovanie pri izbovej teplote, nevyžaduje sa žiadna ochrana pred svetlom.
Izotermické činidlo na amplifikáciu nukleových kyselín:
Amplifikácia dokončená za 5-20 minút, rýchla a účinná; rôzne formy činidiel (lyofilizovaný prášok, lyofilizované mikroguľôčky atď.); rôzne metódy prezentácie výsledkov (elektroforéza, fluorescencia, testovacie prúžky).
Miniaturizované prenosné zariadenia:
Digitálne izotermické detektory, vreckové{0}}veľké testovacie nástroje, ktoré sa ľahko držia v jednej ruke, vybavené power bankou, oslobodzujú vás od obmedzení laboratória a prinášajú presné testovanie nukleových kyselín priamo v teréne.
Jeden/viac testovacích prúžkov:
Optimalizované na základe metodiky MIRA pre lepšiu kompatibilitu; v kombinácii s technológiou MIRA zvýrazňuje pohodlie.
Plne automatizovaný analyzátor amplifikácie nukleových kyselín:
Vyžaduje iba jednu operáciu načítania vzorky pre plne automatizovanú detekciu; limit detekcie na jednu kópiu; izotermické zosilnenie a automatický uzáver znižujú riziko kontaminácie.
Balíček rýchleho testovania na-stránke:
Testovanie-na-mieste, kedykoľvek a kdekoľvek, všetko v jednom balíku; dokončí testovanie za 30 minút, presné a citlivé.
Pre viac informácií o produktoch alebo riešeniach nás neváhajte kontaktovať.