Aeromonas hydrophila je významná patogénna baktéria v akvakultúre, ktorá spôsobuje vážne choroby hospodárskych zvierat a má za následok značné ekonomické straty. Na umožnenie rýchlej{1}}detekcie na mieste sme vyvinuli prenosnú mikrofluidnú platformu, ktorá integruje multi-enzýmovú izotermickú rýchlu amplifikáciu (MIRA) s automatizovaným spracovaním tekutín. Dizajn čipu zahŕňal miniatúrny vibračný motor a keramické vyhrievacie podložky na údržbu
presné riadenie teploty a zabezpečenie homogenity reakcie počas extrakcie a amplifikácie nukleovej kyseliny. Miniatúrne vzduchové čerpadlo poháňalo extrakt surovej DNA cez čip v jedinom pipetovacom kroku, aby bola presnosťkvantifikácia. Extrahovaná DNA bola následne prenesená do reakčnej komory vopred naplnenej MIRAčinidlá na izotermickú amplifikáciu pri 39 stupňoch pri monitorovaní fluorescencie v reálnom čase-. Táto platforma bola zistená
A. hydrophila vo vzorkách vody do 40 minút, pričom sa dosiahol lineárny rozsah od 1 × 10² do 1 × 10⁷ CFU⋅mL−1a limit detekcie (LOD) 10 CFU⋅ml−1. Jeho modulárny dizajn umožňuje jednoduchú výmenu primérov a sond, vďaka čomu je platforma ľahko prispôsobiteľná na detekciu rôznych bakteriálnych patogénov v akvakultúre.
Schematické porovnanie prenosnej mikrofluidnej platformy a konvenčnej detekčnej platformy pre A. hydrophila. (A) Prenosná mikrofluidika
platforma. Pracovný postup detekcie na tejto platforme zahŕňa extrakciu nukleových kyselín, presné pipetovanie, amplifikáciu a detekciu. (B) Konvenčná detekčná platforma. Bežné laboratórne-pracovné postupy sa spoliehajú na sofistikované vybavenie, vyškolený personál a časovo-náročné postupy.
Hodnotenie stability prenosnej mikrofluidnej platformy. (A) Fotografia prenosnej mikrofluidnej platformy. (B, C) Tepelný výkon komôr na extrakciu a detekciu nukleových kyselín. Vzťah medzi keramickou vyhrievacou podložkou a teplotou komory. (D) Stabilita detekcie fluorescencie (N=3). Intenzita fluorescencie sa merala v 5-minútových intervaloch počas procesu amplifikácie.
Hodnotenie výkonu prenosnej mikrofluidnej platformy. (A) Kalibračná krivka pre detekciu A. hydrophila (N=3). Kalibračná krivka sa vytvorila detekciou A. hydrophila v koncentračnom rozsahu 1 × 101 –1 × 108 CFU⋅mL−1za optimálnych podmienok. (B) Hodnotenie reprodukovateľnosti čipu-na{2}}čipu. Test MIRA na A. hydrophila sa uskutočnil na desiatich čipoch vyrobených z každej z dvoch nezávislých foriem. (C) Analýza špecifickosti (N=3). Špecifickosť testu MIRA bola overená voči cieľovej A. hydrophila a 11 necieľovým bakteriálnym druhom. (D) Porovnanie s qPCR (N=3). Platforma aj qPCR sa použili na detekciu A. hydrophila v rôznych koncentráciách. (E) Detekcia kmeňov-izolovaných v teréne (N=3). Pomocou platformy aj qPCR sa detegovali štyri kmene A. hydrophila izolované v teréne.