Molekulárne diagnostické technológie sa dnes vyvíjajú bezprecedentným tempom s významným pokrokom za posledné dva roky. Medzi nimi sa technológie izotermálnej zosilnenia získali väčšiu pozornosť kvôli ich schopnosti vykonávať zosilnenie bez potreby špecializovaného vybavenia. Existuje niekoľko známych metód izotermálnej amplifikácie, ako sú LAMP, RPA a RAA. Dnes však chcem predstaviť novšiu izotermálnu technológiu amplifikačnej technológie-Mira.
Aby sa zabezpečilo, že každý má dôsledné porozumenie kľúčovým pojmom, tu sú niektoré pojmy vysvetlenia:
- Amplifikácia rekombinázy polymerázy (RPA): Toto je technológia amplifikácie sprostredkovaná rekombinázou.
-Amplifikácia podporovaná rekombinázou (RAA): podobná metóda amplifikácie sprostredkovaná rekombinázou.
- Izotermálna amplifikácia sprostredkovaná slučkou (LAMP): Ďalšia technika izotermálnej amplifikácie.
- Multienzým Izotermálna rýchla amplifikácia (MIRA): nová technológia izotermálnej rýchlej amplifikácie.
Rýchle zhrnutie a objasnenie:
Mnohí by sa mohli pýtať, ktorá z týchto rôznych metód izotermálnej amplifikácie je spoľahlivejšia a stabilnejšia. V skutočnosti má každá technológia svoje silné stránky a obmedzenia. Kľúčovými faktormi úspešného prijatia je však schopnosť spoľahlivo škálovať výrobu, nízke náklady a robustný výkon v rôznych aplikáciách.
Teraz stručne analyzujem každú technológiu na základe toho, čo viem:
Lampa (izotermická zosilnenie sprostredkovaná slučkou):
Mnohí v teréne vedia, že Lamp pochádza z Japonska, ktorý vyvinul Dr. Notomi v roku 2000 ako nová technika zosilnenia génov. V súčasnosti vlastníctvo tejto technológie patrí japonskej spoločnosti Eiken Chemical Co., Ltd.
Výhody:
- Vysoká citlivosť (2-5 Rády veľkosti vyššie ako tradičné metódy PCR).
- krátka reakčná doba (reakcie je možné dokončiť v 30-60 minútach).
- Nie je potrebné špeciálne nástroje v oblasti klinického použitia (počas vývoja súpravy sa odporúča turbidimeter v reálnom čase).
- Ľahko sa ovláda (či už detekcia DNA alebo RNA, proces zahŕňa zmiešanie reakčného roztoku, enzýmy a templát v reakčnej trubici, potom inkubujú približne 63 stupňov po dobu 30-60 vo vodnom kúpeli alebo inkubátore, s výsledkami, ktoré je možné pozorovať voľným okom).
Nevýhody:
- Vysoká citlivosť môže mať za následok kontamináciu aerosólu po otvorení trubice, takže je nevhodná na použitie mimo laboratória PCR z dôvodu vysokého rizika falošných pozitív.
- Návrh základov je náročný, takže je nevhodný pre niektoré choroby, najmä tie, ktoré sú spôsobené vírusmi s niekoľkými bežnými sekvenciami.
- Jeho aplikácia je relatívne obmedzená.
RPA a RAA Izotermálne zosilnenie technológií:
Tieto dve metódy sú do značnej miery homológne, pričom hlavným rozdielom je zdroj použitej rekombinázy.
- RPA rekombináza pochádza z bakteriofágu T4.
- Raaova rekombináza je odvodená z baktérií alebo húb.
Kľúčové body pracovného princípu:
1. V prítomnosti ATP sa rekombináza viaže na priméry a tvorí komplex kyseliny proteínovo-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-a-nukleová, ktorý potom hľadá porovnávanie cieľovej DNA.
2. Keď primér nájde zodpovedajúcu templátu DNA, hydrolýza ATP poskytuje energiu pre rekombinázu na opustenie primeru a DNA polymeráza syntetizuje nový reťaz DNA.
3. Súčasne sa jednovláknové proteíny viažuce DNA (SSB) viažu na vytlačenú DNA vlákno, aby sa zabránilo reformácii dvojreťazca.
Výhody:
- Reakcia RPA/RAA je veľmi rýchla, s výsledkami dosiahnuteľnými za približne 30 minút.
- Citlivosť môže dosiahnuť 10 kópií/μl.
- Počas zosilnenia nie je potrebné zložité vybavenie.
-Ďalší vývoj metód založených na sonde alebo koloidnej zlatej chromatografii výrazne zjednodušuje interpretáciu výsledkov, vďaka čomu sú vhodné na použitie v oblasti obmedzených alebo ekonomicky znevýhodnených oblastí.
Nevýhody:
- RPA je technológia vyvinutá britskou spoločnosťou Twistdx, ktorú teraz vlastní Abbott, čo vedie k vysokým nákladom, dlhým dodávateľským cyklom a nedostatku technickej podpory. To v Číne sťažuje rozsiahlu aplikáciu a hromadnú výrobu.
- RAA je čisto domáca technológia, ale chýba jej stabilita, pokiaľ ide o odolnosť proti rušeniu a konzistentnosť činidla v produkte. Výrobný proces pre funkčné enzýmy navyše potrebuje zlepšenie. Aj keď táto technológia je na trhu päť rokov, ešte nebola široko prijatá z dôvodu stability a všestrannosti.
- RPA aj RAA vyžadujú priméry, ktoré sú v dĺžke 30-35 bp. Kratšie priméry ovplyvňujú špecifickosť, citlivosť a rýchlosť zosilnenia, vďaka čomu je návrh základného návrhu náročný.
MIRA (multienzým Izotermálna rýchla amplifikácia):
MIRA je nová technológia izotermálnej amplifikácie zavedená v strednom -2019. Je homológne s RPA a RAA.
Aj keď MIRA zdieľa podobnosti s RPA a RAA z hľadiska pracovných princípov, existujú významné rozdiely vo výbere enzýmov, kultivácii, čistení a ďalších aspektoch veľkej výroby. Technický tím, ktorý stojí za vývojárom Mira, Ampfuture, strávil takmer 11 rokov zdokonaľovaním technológie. Teraz je plne vybavený na podporu rozvoja činidiel pripravených na použitie, zákazného vývoja, výskumných projektov a ďalších prispôsobiteľných služieb.
Výhody:
1. Funkčné proteíny v reagenciách MIRA sa získavajú z rôznych enzýmov, pričom niektoré enzýmy prechádzajú cielenými modifikáciami na zvýšenie účinnosti základného enzýmového systému, čo vedie k komplexnejšiemu systému.
2. Silná odolnosť proti rušeniu a stabilita. Reagenty MIRA prechádzajú rozsiahlou optimalizáciou, pokiaľ ide o výber a koncentráciu kofaktora, spolu s procesmi výroby sušenia zmrazením, čo ich robí odolnejšími voči rušeniu a stabilnejším.
3. Prispôsobenie a všestrannosť. Vzhľadom na úplnú kontrolu nad výrobou funkčných proteínov a hlbokého porozumenia technológie môže byť Mira prispôsobená rôznym aplikáciám, ponúka rôzne systémy činidla a osobné služby prispôsobenia.
4. Vlastnícke patenty. Pretože MIRA je 100% na domácom trhu vyvinutá, počas vývoja produktu neexistuje riziko porušenia patentov. To Mira dáva konkurenčnú výhodu na domácich aj medzinárodných trhoch.
5. Bol stanovený kompletný výrobný protokol, ktorý umožňuje stabilnú veľkú výrobu.
Nevýhody:
1. Rozpoznávanie trhu je stále nízke a na získanie širšieho prijatia je potrebných viac údajov a odkazov z rôznych oblastí (napríklad pozitívne sadzby v rôznych oblastiach).
2. Návrh primerov stále sleduje charakteristiky RPA alebo RAA, ktoré si vyžadujú dlhšie sekvencie primerov alebo sond, ktoré nemusia uľahčiť rýchly prepínač pre súčasných používateľov PCR.