Článok navrhuje novú technológiu mikrofluidných čipov na multiplexovú detekciu patogénnych mikroorganizmov kreviet. Výskumný tím integroval technológiu viacerých enzýmov izotermálnej rýchlej amplifikácie nukleových kyselín (MIRA) a metódy detekcie fluorescencie v reálnom čase. Tento mikrofluidný čip poskytuje rýchle, citlivé a účinné roztok na detekciu hlavných patogénov kreviet na mieste.
Výskum a význam
Globálny poľnohospodársky priemysel je jednou z najdôležitejších ekonomických zložiek v akvakultúre, ale priemysel už dlho čelí hrozbám rôznych patogénnych mikroorganizmov. Tieto patogény často vedú k rozsiahlej smrti krevetov, čo vážne ovplyvňuje výrobné a ekonomické výhody. Vrátane akútnej choroby nekrózy hepatopapancreatickej nekrózy (AHPND), vírusu syndrómu bieleho škvrny (WSSV), infekčného hypodermálneho a hematopoetického nekrózy (IHHNV), hemocytov kreviet hemocytov iridovírus (SHIV) a vírusových hemocytov a parazitových hemocytových hemocytov, vírusov parazitov Plastových píry.
Tradičné metódy detekcie patogénov, ako je polymerázová reťazová reakcia (technológia PCR), majú vysokú citlivosť a špecifickosť, ale sú zložité na prevádzku, trvajú dlho a spoliehajú sa na laboratórne vybavenie. Vďaka týmto obmedzeniam je technológia PCR nevhodná na rýchle testovanie na mieste. Technológia MIRA sa stala nástrojom molekulárnej detekcie vhodný pre aplikáciu na mieste vďaka svojim rýchlym amplifikačným charakteristikám pri konštantnej teplote a normálnej teplote.
Princíp technológie MIRA
Multizýmová konštantná teplota Technológia amplifikácie nukleových kyselín (technológia MIRA) je technológia zosilnenia konštantnej teploty, ktorá sa spolieha na synergiu viacerých funkčných proteínov pri teplote miestnosti, aby sa dosiahla rýchla amplifikácia nukleových kyselín. Je to skutočne prenosná technológia rýchlej detekcie nukleových kyselín na mieste. V porovnaní s PCR má MIRA viac výhod.
Dizajn a inovácie mikrofluidných čipov
Schematický diagram detekčnej platformy RPA na ChIP pre niekoľko dôležitých patogénnych mikroorganizmov kreviet
(A) Štruktúra mikrofluidného čipu typu diskov. 1: reakčná komora; 2: guľový ventil; 3: Výfukový port; 4: Port vzorkovania;
(B) Vybraný pohľad. 5: tepelný tesniaci film; 6: Substrát ChIP.
C) Podrobné usporiadanie šiestich súborov primérov v tomto sektore. Každá súprava primérov je vopred fixovaná v určenom reakčnej komore.
D) Kompletný prevádzkový postup na detekčnej platforme RPA na čipe.
Článok navrhuje mikrofluidný čip integrovaný s technológiou MIRA na multiplexovú detekciu patogénnych mikroorganizmov kreviet. Mikrofluidná technológia môže kontrolovať tekutiny v kanáloch na úrovni mikrónov na presnú manipuláciu, čím sa dosiahne účinná a lacná detekcia viacerých cieľov.
Čip má nasledujúce funkcie dizajnu kľúčov:
● odstredivý mikrofluidný čip
Čip prijíma konštrukciu odstredivého pohonu pomocou odstredivej sily na rovnomerné rozdelenie vzorky do každej reakčnej komory. Tento návrh zjednodušuje proces prevádzky a operátor môže dokončiť celú reakciu jednoduchým vstreknutím vzorky.
● Detekcia viacerých cieľov
Čip je vopred zapnutý bakteriálnymi typmi, ktoré je potrebné detegovať: akútna hepatopankreatická nekróza (V-AHPND), vírus bieleho bodu (WSSV), infekčná subkutánna nekróza vírus (IHHNV) (IHHNV). ) Primerové sondy pre päť patogénov. Tento návrh môže súčasne detekovať šesť génových cieľov v jednej reakcii, čo umožňuje rýchly skríning viacerých patogénov.
● Detekcia fluorescencie v reálnom čase
Amplifikačná reakcia MIRA technológie v čipe je kombinovaná s fluorescenčnou sondou, ktorá môže monitorovať pokrok amplifikačnej reakcie v reálnom čase. Dizajn sondy umožňuje uvoľňovanie fluorescenčného signálu iba vtedy, keď sa generuje produkt amplifikácie, čím sa dosiahne rýchla a citlivá kvantitatívna detekcia.
● Systém s nízkym koncentráciou
Každá reakčná jednotka čipu vyžaduje iba reakčný objem 5 μl, čo výrazne znižuje spotrebu činidla. Keď je celý systém spustený, je možné súčasne spracovať až štyri vzorky a každá vzorka môže detekovať päť patogénov, čo výrazne zlepšuje účinnosť detekcie.
Citlivosť, špecifickosť a opakovateľnosť
Výkon systému ChIP zahŕňa detekciu symetrie, rezonancie a opakovateľnosti.
● Citlivosť
Experimentálne výsledky ukazujú, že ChIP môže detekovať čísla cieľových génových kópií až 10 kópií/μl, s citlivosťou, ktorá je porovnateľná alebo dokonca vyššia ako tradičné metódy PCR. Táto vysoká citlivosť zaisťuje, že táto technológia dokáže zistiť jednotlivcov včasných infikovaných v praktických aplikáciách, čím umožňuje včasné skríning patogénov.
● špecifickosť
Experiment vykonal testy krížovej reakcie na rôznych necieľových patogénoch a výsledky ukázali, že čip je vysoko špecifický pre cieľové patogény a môže presne rozlíšiť rôzne typy patogénov. Všetky testy na akútnu ochorenie nekrózy nekrózy hepatopancreatickej (V-AHPND), vírus bieleho škvrny (WSSV), infekčný hypodermálny a enterohepatitíd nešpecifické zosilnenie.
● Opakovateľnosť
S cieľom vyhodnotiť stabilitu metódy výskumný tím uskutočnil viac opakovaných experimentov. Výsledky ukázali, že variačný koeficient (hodnota CV) medzi rôznymi experimentmi bol nižší ako 10%, čo vykazovalo dobrú experimentálnu opakovateľnosť a konzistentnosť.
Aplikácie v teréne a výhody
Návrh technológie MIRA Microfluidic Chip mu dáva významné výhody aplikácie v teréne, najmä vhodné na rýchlu detekciu a monitorovanie patogénov pri poľnohospodárstve kreviet:
● Pohodlný prevádzkový proces
Celý detekčný proces vyžaduje iba vstrekovanie vzorky do čipu a spustenie reakčného zariadenia. Nevyžaduje sa takmer žiadna manuálna prevádzka a je vhodná pre neprofesionálov, aby sa mohli používať na mieste.
● Schopnosť rýchlej reakcie
Systém môže získať výsledky testov do 20 minút, čo výrazne skráti čas skúšky. To je rozhodujúce pre rýchlu reakciu na ochorenie na farmách a znižovanie šírenia patogénov.
● Schopnosť detekcie multiplexu
Päť hlavných patogénov je možné identifikovať v jednom teste, čo výrazne zlepšuje účinnosť detekcie a šetrí náklady na detekciu a čas.
Vyhliadky na technológiu MIRA
Aj keď technológia PCR je už dlho hodnotená ako zlatý štandard pre detekciu amplifikácie nukleových kyselín, technológia MIRA preukázala veľký aplikačný potenciál v dôsledku rýchlej reakcie pri konštantnej teplote, jednoduchej prevádzke a nízkych požiadavkách na vybavenie. V porovnaní s PCR kombinovaným so sekvenovaním DNA sa zistilo, že výsledky detekcie izotermálneho amplifikačného čipu sú v súlade s výsledkami PCR z hľadiska citlivosti a špecifickosti a reakčný čas technológie MIRA je významne skrátený. Preto sa mikrofluidné čipy MIRA považujú za technológiu vhodnejšiu pre poľné aplikácie, najmä v prostrediach, ktoré vyžadujú rýchlu a rozsiahlu detekciu patogénov.
Mikrofluidné čipy založené na technológii viacerých enzýmov izotermálnych rýchlych amplifikácií nukleových kyselín (MIRA) poskytujú účinný nástroj na detekciu patogénnych mikroorganizmov pri chovu kreviet. Táto technológia má výhody vysokej citlivosti, dobrej špecifickosti, ľahkej prevádzky a rýchlosti rýchlosti detekcie a má široké vyhliadky na prevenciu a kontrolu chorôb akvakultúry. S ďalším vývojom a optimalizáciou tejto technológie sa očakáva, že sa systém použije na detekciu viac vodných patogénov, čo umožní širšiu prevenciu a monitorovanie chorôb.
Výsledky výskumu poskytujú spoľahlivú metódu včasného detekcie pre odvetvie akvakultúry, ktorá môže účinne znížiť riziko prepuknutí chorôb, zlepšiť efektívnosť výroby a produkciu fariem a položiť technický základ pre trvalo udržateľný rozvoj odvetvia akvakultúry.