Viditeľná a rýchla detekcia mačacieho chaphamaparvovírusu pomocou multienzýmovej izotermickej rýchlej amplifikácie a testu s laterálnym prietokom
Denník: Hranice bunkovej a infekčnej mikrobiológie
Impact Factor:4.6
Chaphamaparvovírus mačiek(FeChPV)je nový parvovírus, prvýkrát zistený u mačiek s hnačkou v Kanade v roku 2019. Jeho patogenita a molekulárne charakteristiky zostávajú nejasné a vykazuje hostiteľskú a genetickú diverzitu, čo si vyžaduje ďalšie epidemiologické vyšetrenie. V súčasnosti neexistuje štandardizovaná metóda na detekciu FeChPV.
Metóda multienzýmovej izotermickej rýchlej amplifikácie-meracej tyčinky s laterálnym prietokom (MIRA-LFD)sa úspešne používa na detekciu rôznych vírusov, pričom ponúka výhody ako rýchlosť, jednoduchosť a nie sú potrebné presné prístroje. Výskumný tím vytvoril metódu MIRA-LFD vhodnú pre FeChPV na riešenie problémov pri klinickej detekcii. Bez spoliehania sa na presné prístroje,Metóda MIRA-LFD dokončila detekciu FeChPV pri 37 stupňoch do 20 minút a nepreukázala žiadnu krížovú-reaktivitu s inými vírusmi. Detekčný limit bol 32,3 kópií/μl,10-krát vyššia ako pri metóde PCR. Okrem toho metóda MIRA-LFD detekovala 29 FeChPV-pozitívnych vzoriek medzi 417 mačkami s hnačkou, pričom miera pozitivity bola mierne vyššia ako pri metóde nested PCR. Tieto výsledky naznačujú, že zavedená metóda MIRA-LFD na detekciu FeChPV je efektívna, ekonomická, spoľahlivá a jednoduchá metóda, ktorá prispieva k včasnej prevencii a kontrole infekcie FeChPV.
1. Experimentálne metódy
Klinické vzorky:Vzorky rektálnych výterov použité v tejto štúdii boli odobraté od 632 mačiek (vrátane 417 s hnačkou a 115 zdravých mačiek) a 474 psov (vrátane 342 s hnačkou a 132 zdravých psov) na veterinárnych klinikách v provinciách Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang a autonómnej oblasti Vnútorné Mongolsko2 a medzi 224.
Amplifikácia nukleových kyselín:Do systému MIRA sa pridala extrahovaná DNA nukleová kyselina. Rekombináza a priméry vytvorili komplex; pomocou pomocných proteínov a jednovláknových väzbových proteínov napadli templát dvojvláknovej -DNA. Priméry sa viazali na homológne komplementárne oblasti za vzniku oblasti D-slučky, zatiaľ čo rekombináza sa z komplexu rozložila. Polymeráza sa naviazala na 3' koniec primérov a iniciovala syntézu DNA, exponenciálne amplifikovala cieľovú oblasť na templáte. Tento proces prebiehal rýchlo a efektívne, čím sa dosiahla ultra{8}}rýchla amplifikácia cieľového fragmentu len za 15 minút.
Vývoj farby testovacích prúžkov:Produkt amplifikácie nukleovej kyseliny bol zriedený 1:10, aplikovaný na testovací prúžok a výsledky boli odčítané po 5 minútach.
Celý proces od amplifikácie nukleovej kyseliny po vývoj farby testovacích prúžkov trval iba 20 minút.
V experimente boli použité produkty Amp-future Biological:
V štúdii sa skrínovali štyri navrhnuté sady špecifických kombinácií primérov-sond. Na prezentáciu výsledkov sa použili elektroforéza na agarózovom géli aj testovacie prúžky nukleových kyselín. Všetky štyri kombinácie primérových-sond by mohli detekovať vírus FeChPV. Podľa výsledkov elektroforézy na agarózovom géli kombinácia FeChPV-4 vykazovala najjasnejší cieľový pás, takže táto kombinácia bola vybraná na následné testovanie.
Podľa výsledkov elektroforézy na agarózovom géli amplifikácia počas 5, 10, 15 a 20 minút poskytla cieľový pás. Intenzita cieľového pásu dosiahla vrchol po 15 minútach amplifikácie, čím sa stanovilo 15 minút ako optimálny reakčný čas pre tento test. Amplifikácia pri 36 stupňoch, 37 stupňoch, 38 stupňoch, 39 stupňoch a 40 stupňoch vytvorila cieľový pás s najjasnejším pásom pozorovaným pri 39 stupňoch, čím sa stanovila 39 stupňov ako optimálna reakčná teplota pre tento test.
(Obrázok A: 1: Amplifikácia 5 minút; 2: Amplifikácia 10 minút; 3: Amplifikácia 15 minút; 4: Amplifikácia 20 minút) (Obrázok B: 1: Amplifikácia 36 stupňov; 2: Amplifikácia 37 stupňov; 3: Amplifikácia 38 stupňov; 4: Zosilnenie 40 stupňov; 5
2.Výkon detekcie
Citlivosť:
(Obrázok A: Výsledky MIRA prezentované pomocou elektroforézy na agarózovom géli)
(Obrázok B: Výsledky vnorenej PCR prezentované pomocou elektroforézy na agarózovom géli)
(Obrázok C: Výsledky MIRA prezentované pomocou testovacích prúžkov nukleových kyselín)
Vzorky sa podrobili 10-násobnému sériovému riedeniu počínajúc od 3,23 x 106 kópií/μl. Nested PCR s elektroforézou na agarózovom géli mohla stabilne detegovať 3,23 × 10² kópií/μl; MIRA s elektroforézou na agarózovom géli a MIRA s testovacími prúžkami na nukleové kyseliny by mohli stabilne detegovať 3,23 × 101 kópií/μl.
Metóda MIRA vykazovala konzistentnú citlivosť pri použití dvoch rôznych formátov prezentácie výsledkov a citlivosť metódy MIRA bola lepšia ako citlivosť vnorenej PCR.
Špecifickosť:
(1: FeChPV, mačací chaphamaparvovírus; 2: FPV, vírus panleukopénie mačiek; 3: FeAstV, mačací astrovírus; 4: FBoV, mačací bocavírus; 5: CachaV, psí chaparvovírus; 6: negatívna kontrola)
Novozavedená metóda MIRA-LFD detekovala iba FeChPV a nevykazovala žiadnu krížovú-reaktivitu s inými referenčnými vírusmi, čo naznačuje dobrú špecifickosť.
3.Zhrnutie štúdie
Táto štúdia vytvorila metódu MIRA-LFD na detekciu FeChPV bez potreby-vysoko presných prístrojov. Ako efektívna, ekonomická a spoľahlivá metóda detekcie s vysokou citlivosťou a špecifickosťou je metóda MIRA-LFD vhodnejšia na klinickú detekciu, pretože poskytuje technickú podporu pre včasnú prevenciu a kontrolu infekcie FeChPV.
4.AMP-BIOTECH BUDÚCICH
MIRA multienzýmová izotermická rýchla amplifikácia nukleových kyselín je technológia, ktorá skutočne umožňuje-rýchlu detekciu na mieste.
Technológia MIRA je založená na mechanizme opravy génovej rekombinácie in vivo, pričom sa spolieha na synergické pôsobenie viacerých funkčných proteínov pri izbovej teplote na dosiahnutie rýchlej (5-}20 minút), citlivej, špecifickej a bezpečnej amplifikácie nukleových kyselín pri izbovej teplote (25 stupňov – 45 stupňov). Vzhľadom na izotermický charakter technológie MIRA má nízke nároky na vybavenie a jednoduchú obsluhu. Prostredníctvom miniaturizovaných prenosných zariadení ho možno použiť pri testovaní v prvej línii v rôznych aplikačných scenároch, čím prináša rýchle a presné testovanie nukleových kyselín v prostrediach, ako je POCT, domáce testovanie, poľnohospodárske polia a-presadzovanie práva na mieste. Spoločnosť Amp-future Biotech vyvinula na základe technológie MIRA sériu produktov na rýchle testovanie na mieste- vrátane činidiel na rýchle uvoľňovanie nukleových kyselín, izotermických činidiel na rýchlu amplifikáciu nukleových kyselín, testovacích prúžkov s koloidným zlatom a miniaturizovaných prenosných zariadení, čím vytvorila celkové riešenie pre rýchle molekulárne testovanie{11}}na mieste. Okrem toho technológia MIRA od Amp-future ponúka aplikačné výhody v kombinácii s technológiou CRISPR, NGS, SNP, mikrofluidikou a ďalšími.
Okrem série produktov na rýchle testovanie na mieste uvedených vyššie, Amp-future Biotech tiež poskytuje:
Výskumné činidlá:Poskytovanie reagenčných surovín a technickej podpory pre základný vedecký výskum, ako aj referencie na literatúru projektov.
OEM výroba:Schopnosť nezávisle vyrábať vysoko{0}}čisté, vysoko{1}}aktívne hotové produkty počas celého procesu, čím sa dosiahne priemyselná-výroba.
Vývoj projektu zadaný:Informácie o sekvenciách a výsledky analýzy zarovnania sekvencií, návrh a syntéza sondy priméru{0}}projektu, syntéza a vzorky projektových plazmidov, správy a výsledky projektu atď.
Pre viac informácií, vitajte na dotaz.