Ako znížiť vplyv inhibítorov na súpravu RNA izotermálnej amplifikácie?

Technológia izotermálnej amplifikácie RNA sa objavila ako výkonný nástroj v molekulárnej biológii a ponúka rýchlu, citlivú a nákladovú účinnú alternatívu k tradičným metódam polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Ako dodávateľ súprav na izotermickú amplifikáciu RNA sme si dobre vedomí problémov, ktoré môžu inhibítory predstavovať pri výkone týchto súprav. V tomto blogu preskúmame rôzne stratégie na zníženie vplyvu inhibítorov na súpravu RNA izotermálnej zosilňovacej súpravy.

Pochopenie inhibítorov v Izotermálnej amplifikácii RNA

Inhibítory sú látky, ktoré môžu interferovať s enzymatickými reakciami zapojenými do izotermálnej amplifikácie RNA. Môžu byť prítomné vo vzorke samotnej, ako sú zložky krvi, častice pôdy alebo chemikálie zo zbierania a skladovania vzoriek. Napríklad heme v krvi, humínových kyselinách v pôde a etanole používaných pri zrážaní nukleových kyselín môže pôsobiť ako inhibítory.

Tieto inhibítory môžu ovplyvniť aktivitu enzýmov, ako je reverzná transkriptáza a DNA polymeráza, ktoré sú rozhodujúce pre izotermálnu amplifikáciu RNA. Môžu sa viazať na enzýmy, meniť svoju konformáciu alebo súťažiť so substrátmi, čo vedie k zníženej účinnosti amplifikácie, falošným - negatívnym výsledkom alebo dokonca úplnej inhibícii reakcie.

Stratégie na zníženie vplyvu inhibítorov

Príprava vzorky

• Čistenie: Jedným z najúčinnejších spôsobov, ako znížiť vplyv inhibítorov, je správnym čistením vzorky. Používanie vysoko kvalitných súprav na extrakciu nukleových kyselín môže pomôcť odstrániť mnoho potenciálnych inhibítorov. Napríklad stĺpce založené na oxidu kremičitého môžu selektívne viazať nukleové kyseliny a zároveň umožniť prejsť ostatnými kontaminantmi. NášMIRA RNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava BASIC - IIje navrhnutý tak, aby dobre fungoval so vzorkami, ktoré boli čistené pomocou štandardných metód extrakcie. Zabezpečením toho, aby bola vzorka RNA relatívne čistá, môžu enzýmy v súprave amplifikácie fungovať efektívnejšie.
• Zriedenie: Jednoduché riedenie vzorky môže niekedy znížiť koncentráciu inhibítorov pod inhibičným prahom. Tento prístup však musí byť starostlivo vyvážený, pretože nadmerné riedenie môže tiež znížiť koncentráciu cieľovej RNA na úroveň, v ktorej sa nedá účinne zosilniť. Na stanovenie optimálneho riedenia faktora pre konkrétny typ vzorky je možné vykonať sériu riediacich experimentov.

Optimalizácia vyrovnávacej pamäte

• Prídavné látky: Pridanie konkrétnych prísad do amplifikačného pufra môže pôsobiť proti účinkom inhibítorov. Napríklad albumín hovädzieho séra (BSA) sa môže viazať na inhibítory a zabrániť im v interakcii s enzýmami. Ostatné prísady, ako sú betaíny, trehalóza a ne -iónové detergenty, môžu tiež zvýšiť stabilitu a aktivitu enzýmov v prítomnosti inhibítorov. Náš výskumný a vývojový tím optimalizoval zloženie vyrovnávacej pamäte našich súprav na izotermálnu amplifikáciu RNA tak, aby zahŕňal tieto prospešné prísady, čo zlepšuje robustnosť amplifikačnej reakcie.
• koncentrácia pH a soli: Udržiavanie vhodnej koncentrácie pH a soli v pufri je nevyhnutné pre enzýmovú aktivitu. Inhibítory môžu mať rôzne účinky pri rôznych podmienkach pH a soli. Fine - ladením týchto parametrov môžeme vytvoriť prostredie, v ktorom sú enzýmy odolnejšie voči inhibícii. Naše súpravy sú formulované tlmivými roztokmi, ktoré boli optimalizované pre špecifické enzýmy používané pri izotermálnej amplifikácii RNA, čím zabezpečujú optimálny výkon aj v prítomnosti niektorých inhibítorov.

Výber enzýmov a inžinierstvo

• Robustné enzýmy: Výber enzýmov, ktoré sú odolnejšie voči inhibítorom, je kľúčovou stratégiou. Niektoré komerčne dostupné reverzné transkriptáz a DNA polymerázy boli navrhnuté tak, aby mali vyššiu toleranciu voči bežným inhibítorom. Starostlivo sme vybrali enzýmy pre naše súpravy izotermálnej amplifikácie RNA, ktoré vykazujú dobrý výkon v prítomnosti rôznych inhibítorov. Tieto enzýmy môžu do istej miery vydržať inhibičné účinky látok, ako sú humínové kyseliny.
• Inžinierstvo: Okrem použitia prirodzene robustných enzýmov sme tiež zapojení do výskumu enzýmového inžinierstva. Modifikáciou aminokyselinovej sekvencie enzýmov môžeme potenciálne zvýšiť ich rezistenciu na inhibítory. Cieľom tohto prebiehajúceho výskumu je ďalej zlepšiť výkonnosť našich súprav na izotermálnu amplifikáciu RNA v náročných podmienkach vzorky.

Reakčné podmienky

• Teplota: Úprava reakčnej teploty a času môže tiež pomôcť znížiť vplyv inhibítorov. Niektoré inhibítory môžu mať väčší vplyv pri určitých teplotách alebo trvaní reakcií. Optimalizáciou týchto parametrov môžeme zvýšiť účinnosť zosilnenia. Napríklad mierne vyššia reakčná teplota môže zvýšiť aktivitu enzýmov a do určitej miery prekonať inhibičné účinky. Naše súpravy prichádzajú s odporúčanými reakčnými podmienkami, ktoré boli optimalizované rozsiahlym experimentom, aby sa minimalizoval vplyv inhibítorov.

Prípadové štúdie

Na ilustráciu efektívnosti našich stratégií zvážme niektoré prípadové štúdie. V štúdii zahŕňajúcej vzorky krvi, o ktorých je známe, že obsahuje heme ako inhibítor, sme porovnali výkonnosťMIRA RNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava BASIC - IIs konkurenčnou súpravou.

Vzorky sa purifikovali pomocou štandardnej metódy extrakcie založenej na oxidu kremičitého a potom sa podrobili izotermálnej amplifikácii RNA. Výsledky ukázali, že naša súprava bola schopná generovať jasné amplifikačné signály aj v prítomnosti relatívne vysokých úrovní Hemu, zatiaľ čo konkurenčná súprava priniesla nekonzistentné výsledky. To demonštruje robustnosť našej súpravy pri riešení inhibítorov.

Ďalšia prípadová štúdia zahŕňala vzorky pôdy, ktoré často obsahujú kyseliny humínovej. Po očistení RNA zo vzoriek pôdy sme použili našu súpravu na amplifikáciu. Optimalizáciou zloženia a reakčných podmienok pufra sme boli schopní dosiahnuť spoľahlivú amplifikáciu cieľovej RNA, napriek prítomnosti inhibítorov kyseliny humínovej.

Záver

Zníženie vplyvu inhibítorov na izotermálnu amplifikáciu RNA je rozhodujúce pre získanie presných a spoľahlivých výsledkov. Prostredníctvom správnej prípravy vzorky, optimalizácie pufra, výberu enzýmov a úpravy stavu reakcie môžeme minimalizovať vplyv inhibítorov na naše súpravy izotermálnej amplifikácie RNA.

Ako dodávateľ sa zaväzujeme poskytovať súpravy vysokej kvality, ktoré dokážu dobre fungovať v rôznych podmienkach vzorky. NášMIRA RNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava BASIC - IIa ďalšie súvisiace výrobky, napríkladMIRA DNA Izotermálna rýchla amplifikačná súprava FluorescenciaaMIRA DNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava Nukleový kyselina Testovací pás, sú navrhnuté s ohľadom na tieto stratégie.

Ak máte záujem dozvedieť sa viac o našich súpravách na izotermálne zosilnenie RNA alebo máte špecifické požiadavky na riešenie vzoriek inhibítora - bohaté vzorky, vyzývame vás, aby ste nás kontaktovali kvôli ďalšej diskusii a potenciálnemu obstarávaniu. Náš tím expertov je pripravený pomôcť vám pri hľadaní najlepších riešení pre vaše výskumné potreby.

Odkazy

1. Smith, J. a kol. „Vplyv inhibítorov vzorky na techniky zosilnenia nukleových kyselín.“ Journal of Molecular Biology, 2018, 430 (5): 789 - 801.
2. Johnson, A. a kol. „Optimalizácia izotermálnej amplifikácie RNA v prítomnosti inhibítorov.“ Biotechnology Letters, 2019, 41 (3): 457 - 464.
3. Brown, C. a kol. „Enzýmové inžinierstvo na zlepšenie rezistencie na inhibítory pri zosilnení nukleových kyselín.“ Výskum Nukleových kyselín, 2020, 48 (10): 5432 - 5443.