DNA polymeráza je rozhodujúci enzým v molekulárnej biológii, ktorý zohráva ústrednú úlohu v procesoch replikácie a opravy DNA. V laboratóriu je čistenie DNA polymerázy precízným a viacprúdovým procesom, ktorý si vyžaduje starostlivé plánovanie a vykonávanie. Ako dodávateľ DNA polymerázy som v poriadku - orientujem sa v zložitosti tohto procesu čistenia a chcel by som s vami zdieľať podrobnosti.
Počiatočné kroky: rast buniek a lýza
Prvý krok pri čistení DNA polymerázy často začína rastúcimi bunkami, ktoré exprimujú enzým. Baktérie, ako je napríklad Escherichia coli, sa bežne používajú ako hostiteľské bunky, pretože sa ľahko kultivujú, rýchlo rastú a môžu byť geneticky skonštruované tak, aby nadmerne exprimovali cieľovú DNA polymerázu. Baktérie sa zvyčajne pestujú vo vhodnom kultivačnom médiu za regulovaných podmienok teploty, pH a prevzdušňovania. Napríklad E. coli sa často kultivuje pri 37 ° C v bohatom médiu, ako je vývar Luria - Bertani (LB).
Akonáhle bunky dosiahnú primeranú hustotu, zbierajú sa centrifugáciou. Bunková peleta sa potom resuspenduje v roztoku pufra. Na uvoľnenie DNA polymerázy z buniek sa vykonáva krok lýzy. Existuje niekoľko metód pre bunkovú lýzu, vrátane mechanických metód (ako je sonikácia), chemických metód (s použitím detergentov ako Triton X - 100) a enzymatických metód (pomocou lyzozýmu na rozloženie bakteriálnej bunkovej steny). Sonikácia je populárnou voľbou, pretože môže účinne narušiť bunky bez toho, aby spôsobila výrazné poškodenie enzýmu. Musí sa však starostlivo kontrolovať, aby sa predišlo nadmernému zahrievaniu vzorky, ktorá by mohla denaturovať DNA polymerázu.
Príprava a objasnenie surového extraktu
Po lýze buniek obsahuje výsledná zmes rôzne bunkové zložky vrátane proteínov, nukleových kyselín, lipidov a zvyškov buniek. Toto je známe ako ropný extrakt. Na odstránenie veľkých trosiek v mierke sa surová extrakt centrifuguje pri vysokej rýchlosti. Supernatant, ktorý obsahuje rozpustné proteíny vrátane DNA polymerázy, sa starostlivo zhromažďuje.
Surový extrakt niekedy môže stále obsahovať významné množstvo nukleových kyselín, ktoré môžu interferovať s následnými krokmi čistenia. Na odstránenie týchto nukleových kyselín sa môže zrážkový krok vykonať pomocou polykačnej zlúčeniny, ako je polyetylénimín (PEI). PEI sa viaže na negatívne nabité nukleové kyseliny, čo spôsobuje zrážanie, ktoré sa potom môžu odstrániť odstredením.
Chromatografické čistenie
Chromatografia je základným kameňom čistenia DNA polymerázy. Existuje niekoľko typov chromatografických techník, ktoré sa môžu použiť, každé založené na rôznych princípoch oddelenia.
Ión - výmenná chromatografia
Chromatografia iónov - Exchange je často prvý chromatografický krok v procese čistenia. Oddeľuje proteíny na základe ich čistého náboja. DNA polymerázy majú charakteristický náboj pri danom pH, ktorý im umožňuje viazať sa na pozitívne nabitý (aniónový výmenný) alebo negatívne nabitý (Cation - Exchange) živica. Napríklad, ak má DNA polymeráza pri konkrétnom pH čistý záporný náboj, môže sa použiť aniónová živica, ako je dietylaminoetyl (DEAE) celulóza. Surový extrakt sa načíta na kolóne a DNA polymeráza sa viaže na živicu, zatiaľ čo iné proteíny s rôznymi nábojmi prechádzajú. Viazaná DNA polymeráza sa potom môže eluovať zvýšením koncentrácie soli v pufri. Táto metóda je účinná pri odstraňovaní mnohých kontaminantov a môže významne obohatiť DNA polymerázu vo vzorke.
Chromatografia
Afinitná chromatografia je vysoko špecifická metóda čistenia. Využíva špecifickú interakciu medzi DNA polymerázou a ligandom imobilizovaným na živici. Jedným z bežných prístupov je použitie systému jeho - značiek. Ak bola DNA polymeráza geneticky skonštruovaná tak, aby obsahovala histidínovú značku (HIS - TAG), je možné použiť živicu kyseliny niklu - dusitariatovej (NI - NTA). HIS - TAG sa viaže špecificky na niklové ióny na živici, čo umožňuje selektívne uchovávanie DNA polymerázy na stĺpci. Ostatné proteíny, ktoré nemajú jeho značku, prechádzajú stĺpcom. Viazaná DNA polymeráza sa dá eluovať pridaním imidazolu do pufra, ktorý konkuruje jeho značke o väzbu na niklové ióny.
Ďalším typom afinitnej chromatografie, ktorá sa dá použiť, je DNA - afinitná chromatografia. Pretože DNA polymeráza má prirodzenú afinitu k DNA, môže sa použiť DNA -obsahujúca živíčka. DNA polymeráza sa viaže na DNA na živici a odstránia sa ďalšie proteíny viazaných na DNA. Viazaná DNA polymeráza sa potom môže eluovať zmenou podmienok pufra, ako je zvýšenie koncentrácie soli alebo pridanie konkurenčnej DNA.
Veľkosť - vylúčená chromatografia
Veľkosť - vylučovacia chromatografia, tiež známa ako gélová filtračná chromatografia, oddeľuje proteíny na základe ich veľkosti. Stĺpec je naplnený pórovitými korálkami. Menšie proteíny môžu vstúpiť do pórov guľôčok a mať dlhšiu cestu cez kolón, zatiaľ čo väčšie proteíny prechádzajú priestormi medzi guľôčkami a elute skôr. Táto metóda je užitočná na odstránenie zostávajúcich agregátov alebo kontaminantov s malými molekulárnymi hmotnosťami. Môže sa tiež použiť na stanovenie molekulovej hmotnosti purifikovanej DNA polymerázy.
Konečné čistenie a kontrola kvality
Po chromatografických krokoch je DNA polymeráza zvyčajne vysoko čistená. Stále však môžu byť prítomné niektoré menšie kontaminanty. Konečný leštenie, ako napríklad hydrofóbna interakčná chromatografia alebo chromatografia s reverznou fázou, sa môže vykonať na ďalšie čistenie enzýmu.
Po dokončení čistenia sú nevyhnutné prísne opatrenia na kontrolu kvality. Čistota DNA polymerázy sa môže hodnotiť pomocou techník, ako je elektroforéza gélu sodného - polyakrylamidový gél (SDS - Page). Jeden pás na géli označuje vzorku s vysokou čistotou. Aktivita DNA polymerázy sa môže merať pomocou testu syntézy DNA in vitro. Špecifická aktivita, ktorá je množstvom enzýmovej aktivity na jednotku proteínu, je dôležitým parametrom na vyhodnotenie kvality purifikovanej DNA polymerázy.
Ďalšie súvisiace enzýmy a naše portfólio produktov
Okrem DNA polymerázy ponúka naša spoločnosť aj celý rad ďalších vysoko kvalitných enzýmov pre laboratórny výskum. Napríklad mámeGP41 proteín 2.0, ktorý hrá dôležitú úlohu v procesoch replikácie DNA. Ďalším produktom jeExonukleáza III 2.0, čo je užitočné pre štúdie opravy a modifikácie DNA. A nášSC RECA 2.0je zapojený do homológnych rekombinácií a mechanizmov opravy DNA.
Záver
Čistenie DNA polymerázy v laboratóriu je komplexný, ale odmeňujúci proces. Prostredníctvom starostlivého rastu buniek, lýzy, chromatografického čistenia a kontroly kvality sme schopní získať vysoko čistú a aktívnu DNA polymerázu. Ako dodávateľ DNA polymerázy sa zaväzujeme poskytovať výrobky s najvyššou kvalitou na uspokojenie potrieb vedeckej komunity. Ak vás zaujíma naše produkty DNA polymerázy alebo iné enzýmové výrobky, pozývame vás, aby ste nás kontaktovali kvôli obstarávaniu a ďalším diskusiám. Sme vždy pripravení ponúknuť odborné poradenstvo a podporu, aby sme zaistili, že máte najlepšie - vhodné činidlá pre vaše výskumné projekty.
Odkazy
- Sambrook, J. a Russell, DW (2001). Molekulárne klonovanie: laboratórna príručka. Cold Spring Harbour Laboratory Press.
- Scopes, RK (1994). Čistenie proteínu: princípy a prax. Springer - Verlag.
- Deutscher, MP (1990). Sprievodca čistením proteínov. Akademická tlač.