《Vytvorenie metódy detekcie Micropterus Salmoides
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing Zriadenie detekčnej metódy pre veľkú basovú bass flavivirus založenú na Crisppp/Cas1a []. Čínsky Journal of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10,7541/2023.2023.0199
Micropterus Salmoides, tiež známy ako kalifornské basy alebo americké čierne basy, je sladkovodná ryba pochádzajúca z Severnej Ameriky. V posledných rokoch sa z dôvodu vysokého dopytu po trhu stala dôležitými chovateľnými rybami: Micropterus Salmoides má pevné mäso, málo kostí, chutnú chuť, bohatú výživu, najmä vysoké bielkoviny a nízky obsah tuku, ktoré uspokojujú dopyt spotrebiteľov po zdravých potravinách. Trhová cena je preto relatívne vysoká a často sa používa na trhu so stravovaním špičkových stravovaní. Rýchly rast: Salmoides Micropterus sa rýchlo rastie a vo všeobecnosti dokáže dosiahnuť špecifikácie komodity v 6-8 mesiacoch. Je vhodný na šľachtenie s krátkym cyklom a môže rýchlo realizovať návratnosť investícií. Silná rezistencia na choroby: V porovnaní s inými chovateľnými rybami má Salmoides Micropterus silnú adaptabilitu na životné prostredie, menej prepuknutia chorôb vo veľkom meradle a znižuje riziká rozmnožovania. Ekologické šľachtenie: Largemouth basy sa môžu zmiešať s inými sladkovodnými rybami, ako sú kapre striebra a kapr, ktoré pomáhajú dosiahnuť ekologickú rovnováhu rybníka a maximalizovať využitie zdrojov, ďalej zlepšovať účinnosť šľachtenia a ďalšie faktory. Privítajú ho hostia a poľnohospodári z akvakultúry a jeho šľachtiteľská škála sa v posledných rokoch rýchlo rozrástla.
Aj keď salmoidy Micropterus sú relatívne odolné voči chorobám, stále môžu trpieť určitými chorobami v zlých podmienkach rozmnožovania. Medzi nimi je Rhabdovírus Micropterus Salmoides (MSRV) mimoriadne škodlivý: prvýkrát sa objavil na Floride v USA v roku 1991. Vírus bol pôvodne detegovaný v populáciách divokých largemouth basov a potom sa postupne rozšíril do mnohých sladkovodných jazier a nádrží v Spojených štátoch a stal sa jedným z hlavných patogénov largemoutských bass.
Klinické príznaky chorých rýb
Odpoveď: Zdravé largemouth basy, šípka označuje žĺtkový vak; B: choré largemouth basy, šípka označuje žĺtkový vak.
Zdroj prenosu je často infikovaný poter alebo dospelých rýb, znečistené vodné útvary a divoké ryby nesúce vírus; Tento vírus sa môže prenášať priamym kontaktom, fekálnym vylučovaním a vodnými útvarmi a je pravdepodobnejšie, že sa vyskytuje za zlých kvality vody alebo podmienok šľachtenia s vysokou hustotou. difúzia. Vírus môže spôsobiť letargiu, putovanie, opuch brucha a skreslenie tela v mladistvých rybách, ako aj vyvolať nekrotické vredy a viacorgánske krvácanie. Po infikovaní miera úmrtnosti presahuje 90%.
Klinické príznaky umelo infikovaných salmoidov mikropterus
Odpoveď: Zdravé largemouth basy; B, C, D: umelo infikované largemouth basy.
Každý rok sa v dôsledku MSRV stratí viac ako 30% Salmoides Micropterus Salmoides. V súčasnosti sú metódy liečby a detekcie vírusu stále nezrelé a na liečbu neexistuje špecifická medicína. Preto je veľmi potrebné detegovať vírus v čase pred infekciou a prijať účinné preventívne opatrenia, ktoré môžu do určitej miery znížiť straty v procese šľachtenia;
Okrem toho je ťažké vykonať detekciu na mieste bez zložitých detekčných zariadení s existujúcou detekčnou technológiou. Vzhľadom na túto výzvu vyvinul výskumný tím poľnohospodárskej univerzity v južnej Číne novú detekčnú metódu kombinujúcu MIRA s systémom CRISPR. Táto metóda má silnú špecifickosť, vysokú citlivosť a jednoduchú prevádzku, ktorá výrazne zlepšuje účinnosť detekcie MSRV a tiež pomáha detekovať MSRV čo najskôr a prijímať opatrenia na prevenciu a kontrola.
Skríning kombinácie primerov MIRA
Na amplifikáciu génového fragmentu obsahujúceho cieľovú sekvenciu sa použili dva páry rôznych primérov MIRA a amplifikované produkty sa podrobili elektroforéze agarózového gélu. Graf elektroforézy bol umiestnený v polohe 100 bp a jasné pásy sa objavili vo všetkých troch jazdných pruhoch, čo naznačuje, že existujú nešpecifické amplifikačné produkty. Amplifikované cieľové pásy pri 250 bp v jazdných pruhoch 2 a 3 boli kvantitatívne analyzované softvérom Image J a výsledky kvantitatívnej analýzy boli vyjadrené „šedou hodnotou“. Z výsledkov analýzy je možné vyvodiť záver, že čím nižšia hodnota šedej, tým vyššia je rýchlosť využitia priméru, tým vyššia je účinnosť amplifikácie viazania špecifickej priméru.
Výsledky ukázali, že špecifická účinnosť amplifikácie väzby bola vysoká, keď sa použil pár primérov MIRA-F2/R2.
MIRA primérové párové skríningové elektroforéza gél a analýza šedej hodnoty
a. Elektroforéza Lane M: 2000 bp DNA marker; Elektroforéza dráha 1. Negatívna amplifikácia vzorky DNA; Elektroforéza dráha 2. MIRA-F1/R1 Primérový pár amplifikuje cieľový fragment (224 bp, ako je to znázornené v boxe); elektroforéza pruh 3. MIRA-F2/R2 primárový pár zosilňuje cieľový fragment (255 bp, ako je to znázornené v boxe); b. Analýza pásovej šedej hodnoty (ako je znázornené v rámčeku)
Detekčný systém CRISPR/CAS13A
Po dokončení reakcie detekčného systému CRISPR/CAS13A je ožarované ultrafialovým svetlom, aby sa pozorovali výsledky.
CRISPR/CAS13A Schéma detekcie fluorescencie
1-3. Pridaný celý systém s štandardom RNA; 4. Žiadna crrNA pridaná; 5. Žiadny proteín CAS13A pridaný; 6. Pridá sa žiadna reportérová sonda SSRNA; 7. Negatívna kontrola
Optimálny reakčný systém CRISPR/CAS13A-MSRV
Vykonali sme experimenty s použitím štandardov RNA a amplifikovanej vzorky RNA. Rýchlosť umiestnenia cieľovej RNA bola lepšia s CRRNA2 ako s crrNA1. CRRNA1 mal silnejší konečný fluorescenčný signál ako CRRNA2. Zmiešané použitie crrNA 1+ crRNA2 v rovnakých pomeroch by mohlo kombinovať výhody oboch a dosiahnuť lepšiu účinnosť reakcie.
Optimalizácia detekčných podmienok detekcie CRISPR/CAS13A-MSRV a výsledky detekcie
a. Porovnanie detekčných výsledkov štandardnej RNA s použitím CRRNA s rôznymi sekvenciami spacera;
b. Porovnanie údajov o fluorescenčnom signáli štandardnej RNA detekčnej detekčného systému pri rôznych teplotách;
c. Porovnanie údajov o fluorescenčnom signáli štandardnej RNA detegovanej pomocou RNA reportérových sond s rôznymi koncentráciami;
d. Porovnanie detekčných výsledkov detegovaných štandardných RNA detegovaných s použitím komplexov sond CAS13A/crRNA s rôznymi koncentračnými pomermi;
Na preskúmanie účinku reakčnej teploty na detekčný systém boli stanovené rôzne reakčné teploty 31 stupňov, 34 stupňov, 37 stupňov a 41 stupňov. Optimálna reakčná teplota detekčného systému CRISPR/CAS13A-MSRV bola 37 stupňov.
Aby sa preskúmal účinok koncentrácie reportérovej sondy SSRNA na detekčný systém, v testovacom rozsahu bola intenzita fluorescencie pozitívne korelovaná s koncentráciou reportérovej sondy SSRNA. Detekčný účinok koncentrácie reportérovej sondy SSRNA sa pri 500-700 nmol/l príliš nelíšil. Vzhľadom na skutočné ekonomické problémy bola optimálna koncentrácia reportérovej sondy SSRNA 500 nmol/l.
Na preskúmanie účinku rôznych pomerov koncentrácie reakcie CAS13A a crRNA na detekčný systém, keď pomer CAS13A: crRNA bol 4: 1 a 3: 1 na základe pomeru 100 nmol/l na časť, CAS13A dosiahol saturáciu; Keď bolo množstvo CAS13A konštantné, intenzita fluorescenčného signálu nepositívne korelovala so zvýšením množstva crrNA. Preto, keď je pomer CAS13A k crrNA 2: 1, detekčný systém CRISPR/CAS13A-MSRV môže dosiahnuť maximálnu detekčnú aktivitu.
Vyhodnotenie citlivosti
Aby sa preskúmala minimálna detekčná koncentrácia detekcie MSRV pomocou detekčného systému CRISPR/CAS13A-MSRV, štandard RNA bol zriedený 10-krát v sérii a detekovaný detekčným systémom CRISPR/CAS13A-MSRV. Detekčný systém CRISPR/CAS13A-MSRV môže detekovať najmenej 100 FM cieľovej RNA MSRV. Ak je cieľová koncentrácia RNA nižšia ako 100 FM, fluorescenčný signál detegovaný strojom sa významne nelíši od koncentrácie slepého riadenia. Preto detekčný systém CRISPR/CAS13A-MSRV môže detekovať najmenej 100 FM SSRNA MSRV.
Vyhodnotenie špecifickosti detekčného systému CRISPR/CAS13A-MSRV pre MSRV
Testovanie vzorky
V prípade vzoriek chorých rýb so zjavnými príznakmi chorôb zozbieraných z fariem morských valcov sme overili, či patogén infikovaný chorou rybou bol MSRV. Použili sme priméry špecifické pre kapsidovú proteínovú sekvenciu MSRV na amplifikáciu PCR a na testovanie sme posielali zodpovedajúce pásy v diagrame elektroforézy. Po porovnaní sme potvrdili, že to bol MSRV.
Potvrdenie informácií o sekvencii MSRV
a. Amplifikácia PCR 228 bp produktových pásov primérov MSRV; b. MSRV kapsidová proteínová sekvencia v porovnaní s NCBI, BOLD sekvencie sú protistreamové a downstream väzbové miesta priméru a tieňované oblasti sú cieľové miesta pre väzbu CRISPR/CAS13A-MSRV CRRNA1
Vzorky chorých rýb infikovaných MSRV boli vopred ošetrené a preosilňované pre vírusovú RNA a potom sa testovali s negatívnou kontrolnou skupinou. Zároveň bola extrahovaná cDNA vzoriek na porovnanie s konvenčným qPCR. Pozitívne vzorky (č. 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 a 15) detekcie CRISPR/CAS13A-MSRV boli rovnaké ako výsledky konvenčného qPCR, kde hodnota CQ qPCR bola medzi 18 a 25; Zatiaľ čo počet negatívnych vzoriek prahového cyklu (č. 1, 2, 4, 5, 9, 10 a 11) bol väčší ako 38, čo naznačuje, že vzorky nenašli vírus MSVR. Stručne povedané, údaje o detekcii detekčného systému CRISPR/CAS13A-MSRV a konvenčného RT-QPCR boli konzistentné, čo naznačuje, že systém detekcie CRISPR/CAS13A-MSRV je uskutočniteľný a môže nahradiť pôvodné konvenčné a komplikované detekčné metódy v určitom rozsahu.
Vertikálna porovnávacia tabuľka údajov o detekcii QPCR s QPCR a CRISPR
a. Detekcia qPCR detekcie MSRV klinickej vzorky prahového cyklu čísla cyklu; Detegované číslo cyklu vzorky bolo porovnané s negatívnym číslom referenčného cyklu pomocou analýzy t-testov (** P<0.01);
b. CAS13A v kombinácii s detekciou MIRV klinickej fluorescenčnej schémy MSRV; Detegovaná hodnota fluorescencie vzorky sa porovnávala s negatívnou referenčnou fluorescenčnou hodnotou pomocou analýzy t-testov (** P<0.01)
Stručne povedané, metóda detekcie CRISPR/CAS13A-MSRV stanovená v tejto štúdii nevyžaduje drahé experimentálne nástroje, vďaka čomu je rýchla, presná a pohodlná detekcia detekcie na mieste. Preto, ak sa táto metóda detekcie používa na včasné objavenie MSRV v skutočnom procese šľachtenia a prijať cielené a účinné opatrenia, môže výrazne znížiť straty spôsobené chorobami v procese šľachtenia. Táto metóda detekcie je navyše rýchla, vysoko citlivá a špecifická a má skvelé vyhliadky na aplikáciu a propagáciu.