Ako dodávateľ fluorescenčných detektorov som strávil dosť času premýšľaním o prínosoch a výstupoch týchto šikovných zariadení. Fluorescenčné detektory sú veľmi užitočné vo všetkých druhoch oblastí, od lekárskeho výskumu po monitorovanie životného prostredia. Pracujú tak, že zistia svetlo, ktoré žiarivá látka vyžaruje po tom, čo bola nadšená špecifickou vlnovou dĺžkou svetla. Ale rovnako ako každý kus techniky, majú svoje obmedzenia. Poďme sa ponoriť do toho, čo sú.
Citlivosť a hluk v pozadí
Jedným z hlavných obmedzení fluorescenčných detektorov je citlivosť. Aj keď sú vo všeobecnosti celkom dobré na vyzdvihnutie fluorescenčných signálov, existuje limit pre malý signál, ktorý dokážu zistiť. Toto je veľká vec, keď pracujete so vzorkami, ktoré majú veľmi nízke koncentrácie fluorescenčnej látky. Detektor nemusí byť schopný rozlíšiť slabý signál od šumu pozadia.
Hluk na pozadí je v podstate akékoľvek svetlo, ktoré detektor zdvihne, ktorý nie je z fluorescenčnej látky, o ktorú vás zaujíma. Môže pochádzať z partia zdrojov, ako je túlavé svetlo v laboratóriu, autofluorescencia z matrice vzorky alebo elektrický šum v samotnom detektore. Tento hluk môže sťažovať presne zmerať fluorescenčný signál, najmä ak je slabý.
Napríklad v niektorých lekárskych diagnostických testoch by ste mohli hľadať veľmi malé množstvo konkrétneho biomarkeru vo vzorke krvi pacienta. Ak citlivosť detektora nie je dostatočne vysoká, mohla by vynechať biomarker, čo vedie k falošnému negatívnemu výsledku. A ak je hluk pozadia príliš vysoký, môže to poskytnúť falošný pozitívny výsledok, takže sa zdá, že biomarker je prítomný, keď nie je.
Fotobleaching
FotoBleaching je ďalším veľkým obmedzením. Ak je fluorescenčná molekula vystavená svetlu, môže podstúpiť chemickú zmenu, ktorá spôsobuje, že stratí svoju schopnosť fluorestovať. Toto sa nazýva fotobleaching a môže to byť skutočný problém pri detekcii fluorescencie.
Čím intenzívnejšie je svetlo používané na vzrušenie fluorescenčnej látky, tým rýchlejšie sa môže vyskytnúť fotobleaching. Akonáhle sú molekuly bielené, nemôžete získať späť fluorescenčný signál späť. Môže to byť veľký problém v dlhodobých experimentoch alebo keď potrebujete v priebehu času vykonať viac meraní.
Povedzme, že na štúdium pohybu fluorescenčne značeného proteínu v živej bunke používate detektor fluorescencie. Ak svetlo z detektora spôsobí fotobchodovanie príliš rýchlo, nebudete môcť sledovať bielkovinu veľmi dlho. Môžete získať iba niekoľko snímok svojej počiatočnej polohy skôr, ako fluorescencia zmizne.
Existuje niekoľko spôsobov, ako sa pokúsiť znížiť fotobleaching, napríklad použitie intenzity nižšieho svetla alebo pridanie anti - bieliacich látok do vzorky. Ale tieto riešenia nie sú vždy dokonalé a fotobiely môže stále obmedziť užitočnosť fluorescenčných detektorov v určitých aplikáciách.
Rozsah obmedzenej vlnovej dĺžky
Väčšina fluorescenčných detektorov má obmedzený rozsah vlnových dĺžok, ktoré dokážu zistiť. Každá fluorescenčná látka má špecifickú excitačnú a emisnú vlnovú dĺžku a ak detektor nemôže pokryť príslušné vlnové dĺžky, nebude schopná detegovať fluorescenciu.
Napríklad niektoré nové fluorescenčné farbivá sa vyvíjajú s jedinečným excitačným a emisným spektrám, ktoré sú mimo rozsahu tradičných fluorescenčných detektorov. Ak pracujete s týmito novými farbivami, možno budete potrebovať detektor so širším rozsahom vlnovej dĺžky.
Toto obmedzenie môže byť tiež problémom, keď sa snažíte detekovať viacero fluorescenčných látok súčasne. Rôzne látky majú zvyčajne rôzne emisné vlnové dĺžky, a ak detektor nedokáže všetky pokryť, nebudete schopní zmerať všetky látky súčasne.
Rušenie z iných látok
Fluorescenčné detektory môžu byť ovplyvnené inými látkami vo vzorke. Niektoré látky môžu uhasiť fluorescenciu cieľovej molekuly. Zhasenie je, keď molekula redukuje intenzitu fluorescencie inej molekuly prostredníctvom fyzikálnej alebo chemickej interakcie.
Napríklad určité kovové ióny alebo iné chemické zlúčeniny vo vzorke sa môžu viazať na fluorescenčnú molekulu a meniť svoju štruktúru spôsobom, ktorý znižuje jej schopnosť fluorestovať. To môže viesť k podceneniu koncentrácie cieľovej látky.
Pri monitorovaní životného prostredia, ak sa snažíte zistiť fluorescenčnú znečisťujúcu látku vo vzorke vody, môžu existovať ďalšie látky vo vode, ktoré môžu uhasiť fluorescenciu znečisťujúcej látky. Mohlo by to vyzerať, že znečisťujúca látka je prítomná v nižšej koncentrácii, ako v skutočnosti je.
Citlivosť na teplotu a pH
Fluorescenčné vlastnosti mnohých látok sú citlivé na teplotu a pH. Zmena teploty alebo pH môže ovplyvniť štruktúru fluorescenčnej molekuly, ktorá môže zase zmeniť svoje excitačné a emisné spektrá, ako aj intenzitu fluorescencie.
Ak teplota alebo pH vzorky nie sú správne kontrolované, môže to viesť k nepresným výsledkom. Napríklad v biologickej vzorke sa môže pH líšiť v závislosti od použitého pufra alebo metabolickej aktivity buniek. Ak detektor fluorescencie nie je kalibrovaný pre tieto zmeny, môže poskytnúť nesprávne merania.
Povedzme, že na meranie pH roztoku pomocou fluorescenčného farbiva citlivého na pH používate fluorescenčný detektor. Ak sa teplota roztoku počas merania zmení, môže ovplyvniť fluorescenciu farbiva, čo dáva nepresné čítanie pH.
Náklady a zložitosť
Fluorescenčné detektory môžu byť dosť drahé, najmä s vysokými koncovými modelmi s pokročilými vlastnosťami, ako je vysoká citlivosť a rozsah širokej vlnovej dĺžky. Náklady na nákup a údržbu týchto detektorov môžu byť hlavnou prekážkou pre niektoré výskumné laboratóriá alebo malé podniky.
Okrem nákladov môžu byť fluorescenčné detektory tiež zložité do prevádzky. Často vyžadujú špecializované školenie na zriadenie, kalibráciu a riešenie problémov. A ak sa niečo pokazí, môže to byť ťažké a čas - náročné.
NapríkladIzotermický fluorescenčný detektoraDigitálny izotermický fluorescenčný detektorsú pokročilé zariadenia, ktoré ponúkajú detekciu fluorescencie s vysokým výkonom. Ich zložitosť však znamená, že používatelia musia mať dobré pochopenie technológie, aby z nich vyťažili maximum.
Záver
Napriek týmto obmedzeniam sú detektory fluorescencie v mnohých oblastiach stále neuveriteľne cennými nástrojmi. V našej spoločnosti neustále pracujeme na prekonaní týchto výziev a na zlepšení výkonnosti našich detektorov. Vyvíjame nové technológie na zvýšenie citlivosti, zníženie hluku v pozadí a minimalizáciu fotobieskovania.
Ak ste na trhu s detektorom fluorescencie, alebo ak máte akékoľvek otázky o tom, ako obísť tieto obmedzenia vo svojej konkrétnej aplikácii, neváhajte osloviť. Sme tu, aby sme vám pomohli nájsť najlepšie riešenie pre vaše potreby. Či už ste výskumný pracovník vo veľkom laboratóriu alebo majiteľ malej firmy, ktorý hľadá spoľahlivý detekčný systém, máme odborné znalosti a produkty, ktoré vás podporujú. Poďme sa porozprávať o tom, ako pre vás môžeme fungovať detekcia fluorescencie.
Odkazy
- Lakowicz, Jr (2006). Princípy fluorescenčnej spektroskopie. Springer Science & Business Media.
- Valeur, B. (2002). Molekulárna fluorescencia: princípy a aplikácie. Wiley - vch.