Súpravy izotermálnej amplifikácie RNA spôsobili revolúciu v oblasti molekulárnej biológie, čo umožnilo rýchlu a účinnú amplifikáciu molekúl RNA pri konštantnej teplote. Tieto súpravy sa široko používajú v rôznych aplikáciách vrátane detekcie patogénov, analýzy génovej expresie a diagnostiky choroby. Jednou zo spoločných výziev, ktorým čelí pri použití súprav na izotermickú amplifikáciu RNA, je však prítomnosť hluku v pozadí, ktorá môže významne ovplyvniť presnosť a spoľahlivosť výsledkov. Ako popredný dodávateľ súprav na izotermálne amplifikáciu RNA chápeme dôležitosť minimalizácie hluku v pozadí, aby sme zaistili vysokokvalitné a reprodukovateľné výsledky. V tomto blogovom príspevku budeme diskutovať o niektorých účinných stratégiách na zníženie hluku v pozadí súpravy na izotermálnu zosilnenie RNA.
Pochopenie hluku v pozadí v Izotermálnej amplifikácii RNA
Predtým, ako sa ponoríte do stratégií na zníženie hluku v pozadí, je nevyhnutné pochopiť, čo ho spôsobuje. Šum v pozadí v izotermálnej amplifikácii RNA môže vzniknúť z niekoľkých zdrojov vrátane:
- Kontaminácia: Kontaminácia reakčnej zmesi exogénnou RNA, DNA alebo inými biomolekúlmi môže viesť k nešpecifickej amplifikácii a zvýšeniu signálu pozadia. Môže sa to vyskytnúť počas prípravy, manipulácie alebo skladovania vzorky.
- Enzýmová aktivita: Enzýmy používané v izotermálnej amplifikačnej reakcii, ako je reverzná transkriptáza a DNA polymeráza, môžu vykazovať nešpecifickú aktivitu, čo vedie k zosilneniu nezamýšľaných cieľov a šumu pozadia.
- Dizajn základného náteru: Slabo navrhnuté priméry môžu žíhať na necieľové sekvencie vo vzorke, čo vedie k nešpecifickej amplifikácii a zvýšenému signálu pozadia.
- Reakčné podmienky: Suboptimálne reakčné podmienky, ako je nesprávna teplota, zloženie pufra alebo koncentrácia enzýmov, môžu tiež prispievať k hluku v pozadí.
Stratégie na zníženie hluku v pozadí
1. Príprava a manipulácia s vzorkou
- Používajte vysoko kvalitnú RNA: Začnite s vysokokvalitnými vzorkami RNA, ktoré neobsahujú kontamináciu. Používajte správne techniky izolácie RNA a uistite sa, že RNA je uložená pri vhodnej teplote, aby sa zabránilo degradácii.
- Čistý pracovný priestor: Udržiavajte čistý a špecializovaný pracovný priestor na prípravu vzorky, aby ste minimalizovali riziko kontaminácie. Používajte jednorazové rukavice, špičky pipety a trubice a pravidelne čistite pracovnú stolu a vybavenie vhodnými dezinfekčnými prostriedkami.
- Tipy na filtra: Použite tipy na filtračné pipety, aby ste zabránili krížovej kontaminácii medzi vzorkami a činidlami.
- Alikvotné činidlá: Alikvot činidiel na malé objemy, aby sa minimalizovalo riziko kontaminácie a zabezpečili konzistentné výsledky.
2. Návrh základov
- Optimalizovať primerové sekvencie: Návrh primérov, ktoré sú špecifické pre cieľovú sekvenciu RNA a majú minimálnu homológiu na necieľové sekvencie. Na zabezpečenie optimálnej teploty topenia primérov, dĺžky a obsahu GC použite softvér na návrh primerov.
- Vyvarujte sa samovelodarnosti: Vyhnite sa primérom so samostatnými sekvenciami alebo schopnosťou tvoriť vlasové štruktúry, pretože tieto môžu viesť k nešpecifickej zosilneniu a zvýšeniu šumu pozadia.
- Testovacia špecifickosť primerov: Pred použitím primérov v amplifikačnej reakcii otestujte ich špecifickosť vykonaním kontrolnej reakcie s necieľnou vzorkou RNA.
3. Výber a optimalizácia enzýmov
- Vyberte vysokokvalitné enzýmy: Vyberte vysoko kvalitné enzýmy s nízkou nešpecifickou aktivitou. Vyhľadajte enzýmy, ktoré boli špecificky optimalizované pre izotermické amplifikačné reakcie.
- Optimalizovať koncentráciu enzýmov: Stanovte optimálnu koncentráciu enzýmov pre amplifikačnú reakciu vykonaním titračného experimentu. Použitie príliš veľkého množstva enzýmu môže zvýšiť riziko nešpecifickej amplifikácie a šumu pozadia, zatiaľ čo použitie príliš malého enzýmu môže viesť k neefektívnej amplifikácii.
- Aditívny agent: Niektoré prísady, ako napríklad betaine, hovädzí sérový albumín (BSA) alebo dimetylsulfoxid (DMSO), môžu zlepšiť špecifickosť a účinnosť amplifikačnej reakcie a znížiť šum pozadia. Experimentujte s rôznymi prísadami, aby ste našli optimálnu kombináciu vašej reakcie.
4. Reakčné podmienky
- Optimalizovať teplotu: Uistite sa, že amplifikačná reakcia sa vykonáva pri optimálnej teplote použitých enzýmov. Odchýlky od odporúčanej teploty môžu viesť k nešpecifickému zosilneniu a zvýšenému hluku v pozadí.
- Zloženie vyrovnávacej pamäte: Použite odporúčanú kompozíciu vyrovnávacej pamäte poskytnuté výrobcom súpravy. Túffer hrá rozhodujúcu úlohu pri udržiavaní stability a aktivity enzýmov a môže ovplyvniť špecifickosť a účinnosť amplifikačnej reakcie.
- Reakčný čas: Optimalizujte reakčný čas na zabezpečenie úplného amplifikácie cieľovej RNA a zároveň minimalizuje nešpecifickú amplifikáciu. Dlhšie reakčné časy môžu zvýšiť riziko hluku v pozadí.
5. Použitie inhibítorov
- Inhibítory RNázy: Pridajte do reakčnej zmesi inhibítory RNázy, aby ste zabránili degradácii vzorky RNA a znížte hluk pozadia.
- Inhibítory DNA polymerázy: Niektoré inhibítory DNA polymerázy sa môžu použiť na potlačenie nešpecifickej amplifikácie a zníženie šumu pozadia. Tieto inhibítory by sa však mali používať opatrne, pretože môžu ovplyvniť aj účinnosť amplifikačnej reakcie.
Naše súpravy na izotermálne zosilnenie RNA
V našej spoločnosti ponúkame celý rad vysokokvalitných súprav na izotermické zosilnenie RNA vrátaneMIRA RNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava Nukleový kyselina Testovaný pásik. Naše súpravy sú navrhnuté tak, aby poskytovali rýchle, citlivé a špecifické zosilnenie cieľov RNA s minimálnym hlukom v pozadí.
- Vysoká citlivosť: Naše súpravy môžu detekovať nízke hladiny cieľov RNA, čo ich robí vhodnými pre širokú škálu aplikácií vrátane detekcie patogénov a analýzy génovej expresie.
- Špecifickosť: Priméry a enzýmy používané v našich súpravách sú starostlivo navrhnuté a optimalizované, aby sa zabezpečila vysoká špecifickosť a minimálna nešpecifická amplifikácia.
- Ľahké použitie: Naše súpravy sa ľahko používajú a prichádzajú s podrobnými pokynmi, vďaka čomu sú vhodné pre skúsených výskumných pracovníkov aj pre začiatočníkov.
- Rýchle výsledky: Izotermálna amplifikačná reakcia sa môže dokončiť v krátkom čase, čo umožňuje rýchlu detekciu a analýzu cieľov RNA.
Okrem súpravy na izotermálnu zosilnenie RNA ponúkame ajMIRA DNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava Nukleový kyselina Testovací pásaMIRA DNA Izotermálna rýchla amplifikačná súprava Fluorescenciana amplifikáciu DNA.
Kontaktujte nás kvôli obstarávaniu a konzultácii
Ak vás zaujíma naše súpravy na izotermálne zosilnenie RNA alebo máte akékoľvek otázky týkajúce sa zníženia hluku v pozadí v reakciách izotermálnej zosilnenia, neváhajte nás kontaktovať. Náš tím odborníkov je k dispozícii, aby vám poskytol technickú podporu, informácie o produkte a pomoc pri vašich výskumných potrebách. Tešíme sa na spoluprácu s vami na dosiahnutí presných a spoľahlivých výsledkov v experimentoch molekulárnej biológie.
Odkazy
- Dieffenbach, CW a Dveksler, GS (2003). Primér PCR: laboratórna príručka. Cold Spring Harbour Laboratory Press.
- Kurn, N., & Kramer, FR (2008). Amplifikácia založená na sekvencii nukleových kyselín. Ročný prehľad analytickej chémie, 1, 25–47.
- Van Ness, J., & Chen, D. (2003). Technológie izotermálnej amplifikácie nukleovej kyseliny. Clinical Chemistry, 49 (10), 1638 - 1647.