Systém Crispr -CAS revolúciou v oblasti úpravy génov kvôli jeho jednoduchosti, vysokej špecifickosti a efektívnosti. Rovnako ako každá technológia však nie je bez obmedzení. Jednou z výziev v aplikácii Crispr - CAS je dosiahnutie vysokej účinnosti génovej úpravy, najmä v zložitých genómoch a v určitých typoch buniek. Rekombinázy, enzýmy, ktoré katalyzujú genetickú rekombináciu, majú veľký sľub pri zvyšovaní účinnosti systémov CRISPR -CAS. Ako dodávateľ rekombinázy som nadšený, že môžem preskúmať, ako možno tieto silné enzýmy integrovať s CRISPR - CAS na odomknutie nových možností pri úprave génov.
Pochopenie systému Crispr - CAS
Systém Crispr - CAS je prirodzený obranný mechanizmus v baktériách a archaea proti napadnutiu vírusov a plazmidov. Skladá sa z vodiacej RNA (GRNA), ktorá sa zameriava na špecifickú DNA sekvenciu a nukleázu CAS, ktorá štiepi DNA v cieľovom mieste. Akonáhle je DNA štiepená, prichádzajú do hry prirodzené opravy bunky. Existujú dve hlavné opravy: Non - homológny koniec - spojenie (NHEJ) a homológia - riadená oprava (HDR). NHEJ je chyba - náchylná a často vedie k malým inzerciám alebo deléciám (indely), zatiaľ čo HDR sa môže použiť na zavedenie presných genetických zmien, keď je poskytnutá šablóna DNA DNA.
Účinnosť úpravy génov sprostredkovaného CRISPR - CAS závisí od niekoľkých faktorov, vrátane dodania nukleázy CAS a GRNA do cieľových buniek, aktivity nukleázy CAS v cieľovom mieste a účinnosti dráh opravy DNA. V mnohých prípadoch je nízka účinnosť HDR hlavným problémom, najmä v primárnych bunkách a in vivo aplikáciách.
Ako môžu rekombinázy zvýšiť CRISPR - CAS EFELINGICITIONICITY
1. Uľahčenie homológie - Riadené opravy (HDR)
Rekombinázy môžu hrať rozhodujúcu úlohu pri podpore HDR. Jedným z kľúčových krokov v HDR je invázia templátu DNA darcu do štiepenej DNA na cieľovom mieste. Rekombinázy, ako je RECA v baktériách, môžu tvoriť nukleoproteínový vlákn na DNA darcu. Toto vlákno potom môže hľadať homológne sekvencie v štiepnej DNA a podporovať inváziu vlákna, čo je kritickým krokom v HDR.
Napríklad pomocou CO - dodávaním rekombinázy so systémom CRISPR - CAS a šablónou DNA DNA môžeme zvýšiť pravdepodobnosť úspešných udalostí HDR. Ukázalo sa, že tento prístup významne zlepšuje účinnosť presných úprav génov v rôznych typoch buniek. Rekombináza pomáha prekonať kinetické bariéry spojené s HDR, čo sťažuje, že bunka je pravdepodobnejšie, že používa šablónu DNA Donor na opravu namiesto toho, aby sa uchýlila k chybám - náchylnou dráhou NHEJ.
2. Zlepšenie špecifickosti zacielenia
Okrem podpory HDR môžu rekombinázy tiež zvýšiť špecifickosť cieľa systému CRISPR -CAS. Niektoré rekombinázy majú schopnosť rozpoznať a viazať sa na špecifické DNA sekvencie s vysokou afinitou. Inžinierstvom rekombinázy na interakciu s komplexom Crispr -CAS môžeme zvýšiť špecifickosť nukleázy CAS pre cieľové miesto.
To sa dá dosiahnuť fúziou rekombinázy do nukleázy CAS alebo pomocou systému založeného na rekombináze v kombinácii s CRISPR - CAS. Rekombináza môže pomôcť viesť nukleázu CAS k správnemu cieľovému miestu, čím sa zníži účinky cieľa. Účinky OFF - Cieľ sú hlavným problémom v aplikáciách Crispr - CAS, pretože môžu viesť k nezamýšľaným genetickým zmenám a potenciálnym problémom s bezpečnosťou. Zlepšením zacielenia na špecificitu môžu rekombinázy zvýšiť spoľahlivejší a bezpečnejší systém Crispr a bezpečnejší na použitie pri génovej terapii a ďalších aplikáciách.
3. Prekonanie chromatínových bariér
Štruktúra chromatínu môže predstavovať významnú bariéru prístupu k systému CRISPR -CAS k cieľovej DNA. DNA v eukaryotických bunkách je pevne balená histónovými proteínmi za vzniku chromatínu, ktorý môže obmedziť väzbu Nukleázy CAS a GRNA na cieľové miesto. Rekombinázy môžu pomôcť prekonať tieto chromatínové bariéry.
Niektoré rekombinázy majú schopnosť interagovať s proteínmi spojenými s chromatínom a modifikovať štruktúru chromatínu v blízkosti cieľového miesta. To môže zvýšiť dostupnosť cieľovej DNA pre systém CRISPR -CAS, čím sa zvýši účinnosť úpravy génov. Napríklad použitím rekombinázy, ktorá dokáže remodelovať chromatín, môžeme zvýšiť väzbu nukleázy CAS a gRNA na cieľové miesto, čo vedie k účinnejšiemu štiepeniu DNA a následnej opravy.
Naše výrobky rekombinázy a ich potenciál v oblasti zvýšenia CRISPR - CAS
Ako dodávateľ rekombinázy ponúkame celý rad vysoko kvalitných výrobkov rekombinázy, ktoré sú vhodné na zvýšenie účinnosti CRISPR -CAS systémov. Naše rekombinázy sú starostlivo vyčistené a charakterizované, aby sa zabezpečila optimálny výkon v aplikáciách génových úprav.
Okrem našich produktov rekombinázy ponúkame aj ďalšie enzýmy, ktoré sa môžu použiť v kombinácii s CRISPR - CAS a rekombinázami na ďalšie zvýšenie účinnosti génovej úpravy. NapríkladExonukleáza III 2.0Môže sa použiť na spracovanie koncov šablóny DNA darcu, vďaka čomu je vhodnejšia pre HDR.M - MLV H - 2,0Môže sa použiť na reverznú transkripciu, ktorá môže byť užitočná v niektorých stratégiách úpravy génov. ADNA polymeráza 2.0Môže byť použitý na syntézu šablóny DNA darcu alebo na vyplnenie medzier počas procesu opravy.
Prípadové štúdie a aplikácie
Uskutočnilo sa niekoľko úspešných prípadových štúdií, ktoré preukazujú použitie rekombináz na zvýšenie účinnosti Crispr - CAS. V jednej štúdii vedci použili systém CRISPR -CAS rekombinázy na korekciu genetickej mutácie v ľudských pluripotentných kmeňových bunkách (IPSC). CO - dodávaním rekombinázy s komponentmi CRISPR - CAS a templátom DNA DONORS boli schopní dosiahnuť výrazne vyššiu účinnosť HDR v porovnaní s použitím samotného systému CRISPR - CAS. Tento prístup má potenciálne aplikácie pri génovej terapii genetických chorôb, pretože umožňuje presnú korekciu mutácií spôsobujúcich ochorenie.
V inom prípade sa rekombinázy použili na zlepšenie cieľovej špecifickosti systému CRISPR -CAS v rastlinách. Inžinierstvom zacieľovacieho systému založeného na rekombináze boli vedci schopní znížiť účinky z OFF - cieľové účinky a zvýšiť účinnosť úpravy génov v rastlinách plodín. To má dôsledky pre poľnohospodársku biotechnológiu, pretože sa dá použiť na vývoj plodín so zlepšenými vlastnosťami, ako je rezistencia na choroby a zvýšený výťažok.
Záver a výzva na akciu
Rekombinázy majú veľký potenciál pri zvyšovaní účinnosti systémov CRISPR -CAS. Podporovaním HDR, zlepšením zamerania na špecifickosť a prekonaním chromatínových bariér sa rekombinázy môžu zaoberať niektorými kľúčovými obmedzeniami technológie CRISPR - CAS. Ako dodávateľ rekombinázy sa zaväzujeme poskytovať vysoko kvalitné výrobky a technickú podporu výskumným pracovníkom a biotechnologickým spoločnostiam pracujúcim v oblasti úprav génov.
Ak máte záujem preskúmať použitie rekombinácií na zlepšenie vašich aplikácií CRISPR - CAS, vyzývame vás, aby ste nás kontaktovali pre viac informácií. Náš tím odborníkov vám môže pomôcť vybrať si správne produkty Recombinázy a poskytnúť pokyny týkajúce sa experimentálneho dizajnu. Tešíme sa na spoluprácu s vami na postúpení poľa génových úprav a priniesť nové riešenia do stola.
Odkazy
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA, & Charpentier, E. (2012). Programovateľná duálna - RNA - riadená endonukleáza DNA v adaptívnej bakteriálnej imunite. Science, 337 (6096), 816 - 821.
- Mali, P., Yang, L., Esvelt, KM, Aach, J., Guell, M., Dicarlo, JE, ... & Church, GM (2013). RNA - riadené ľudské genómové inžinierstvo prostredníctvom Cas9 Science, 339 (6121), 823 -
- Li, X., Yang, Y., & Zhang, Y. (2016). Rekombineering: homológna metóda genetického inžinierstva založeného na rekombinácii. Nature Protocols, 11 (3), 476 - 492.
- Pinder, JC a Cheng, AW (2019). Zlepšenie úpravy génu CRISPR - CAS9 s DNA - zacieľujúcimi sa na rekombinázy. Metódy v molekulárnej biológii, 1970, 273 - 285.