Yo, kolegovia vedeckých nadšencov! Som nadšený, že som sa s vami porozprával o optimalizácii DNA polymerázy pre vysoko - priepustné sekvenovanie DNA. Ako dodávateľ DNA polymerázy som videl z prvej ruky, aké rozhodujúce je mať pre túto technológiu rezania - notch polymerázu.
Vysoko - priepustné sekvenovanie DNA revolúciou genomiky. Umožňuje nám sekvenovať veľké množstvo DNA v krátkom čase, čo je veľmi dôležité pre veci, ako je personalizovaná medicína, porozumenie genetickým chorobám a dokonca aj evolučné štúdie. Ale aby to fungovalo naozaj dobre, potrebujeme optimalizovanú DNA polymerázu.
Začnime tým, čo vlastne robí DNA polymeráza. Je to enzým, ktorý syntetizuje nové vlákna DNA pridaním nukleotidov do rastúceho reťazca. Pri vysoko - priepustnom sekvenovaní chceme, aby fungovalo rýchlo, presné a spracúvajú rôzne typy šablón DNA.
Rýchlosť
Jedným z kľúčových faktorov pri vysokom priepustnom sekvenovaní je rýchlosť. Čím rýchlejšie môže DNA polymeráza pridať nukleotidy, tým rýchlejšie môžeme vykonať sekvenovanie. Aby sme optimalizovali rýchlosť, môžeme sa pozrieť na katalytickú rýchlosť enzýmu. Niektoré mutácie môžu zvýšiť túto mieru. Napríklad modifikácia aktívneho miesta polymerázy sa môže efektívnejšie viazať na nukleotidy a rýchlejšie ich pridať k rastúcemu prameňu DNA.
Zistili sme tiež, že úprava reakčných podmienok môže zvýšiť rýchlosť. Použitie správneho pufra s optimálnymi koncentráciami pH a iónov môže mať veľký rozdiel. Napríklad ióny horčíka sú základnými faktormi aktivity DNA polymerázy. Jemne - ladením koncentrácie horčíka môžeme zvýšiť rýchlosť enzýmu.
Presnosť je kľúčová
Presnosť je rovnako dôležitá ako rýchlosť. Pri sekvenovaní môže jedna chyba viesť k nesprávnej interpretácii genetických údajov. DNA polymerázy majú aktivitu korektúry, čo pomáha správne chyby počas syntézy DNA. Aby sme optimalizovali presnosť, môžeme vylepšiť túto funkciu korektúry. Niektoré z našich polymeráz, napríkladM - MLV H - 2,0boli navrhnuté tak, aby mali vylepšené korektúry. To znamená menej chýb a spoľahlivejšie výsledky sekvenovania.
Ďalším spôsobom, ako zlepšiť presnosť, je zníženie ne -špecifickej väzby. Niekedy sa polymeráza môže viazať na nesprávnu šablónu alebo pridať nukleotidy na nesprávnom mieste. Úpravou štruktúry polymerázy tak, aby bola špecifickejšia pre správnu šablónu DNA, tieto chyby môžeme minimalizovať.
Manipulácia s rôznymi šablónami
DNA prichádza vo všetkých tvaroch a veľkostiach a sekvenovanie vysokej priepustnosti sa často zaoberá rôznymi šablónami. Niektoré šablóny môžu byť ťažké sekvenovať, napríklad tie, ktoré majú vysoký obsah GC alebo sekundárne štruktúry. Aby sme optimalizovali DNA polymerázu pre tieto náročné šablóny, môžeme pridať doplnkové proteíny. NapríkladSC RECA 2.0môže pomôcť uvoľniť sekundárne štruktúry DNA, čo uľahčuje prístup k polymeráze prístup k šablóne a syntetizovať novú DNA.
Môžeme tiež modifikovať polymerázu samotnú tolerantnejšiu voči rôznym šablónom. Niektoré mutácie môžu zlepšiť enzým pri riešení vysokého obsahu GC alebo iných oblastí - sekvenčných oblastí.
Stabilita a dlhovekosť
Pri vysoko - priepustnom sekvenovaní musí polymeráza pracovať dlho bez straty svojej aktivity. Môžeme optimalizovať stabilitu úpravou štruktúry enzýmov tak, aby bola odolnejšia voči denaturácii. Napríklad pridanie disulfidových väzieb môže zvýšiť stabilitu proteínu.
Ďalším aspektom je enzýmova polica - život. Chceme, aby naše polymerázy zostali počas skladovania dlho aktívni. Formuláciou pravého pufra a podmienok skladovania môžeme zabezpečiť, aby polymeráza zostala stabilná a v prípade potreby pripravená na použitie.
Kompatibilita so sekvencovacími platformami
Rôzne platformy pre sekvenovanie priepustnosti majú svoje vlastné požiadavky. Napríklad niektoré platformy používajú detekciu založenú na fluorescencii, zatiaľ čo iné používajú technológiu nanopore. Musíme optimalizovať DNA polymerázu, aby bola kompatibilná s týmito rôznymi platformami.
Pre platformy založené na fluorescencii by polymeráza nemala interferovať s fluorescenčnými signálmi. Môžeme navrhnúť polymerázu tak, aby sme mali nízku fluorescenciu pozadia a aby sme dobre fungovali s farbivami používanými pri sekvenčnej reakcii.
Pri sekvenovaní nanopore musí byť polymeráza schopná pracovať pri špecifických elektrických a chemických podmienkach nanopóra. Pochopením týchto požiadaviek môžeme modifikovať polymerázu tak, aby bola vhodnejšia pre tento typ sekvenovania.
Naše portfólio produktov
Ako dodávateľ DNA polymerázy ponúkame celý rad výrobkov určených na uspokojenie potrieb vysoko -priepustného sekvenovania. NášM - MLV H - 2,0je vynikajúci pre reverzný prepis a má vynikajúcu presnosť. TenSC RECA 2.0Môže byť použitý ako doplnkový proteín na zlepšenie spracovania šablón. A nášExonukleáza III 2.0Môže sa použiť pre rôzne kroky spracovania DNA pri sekvencovaní pracovných tokov.
Ak ste na trhu s vysokou kvalitou DNA polymeráz pre vaše projekty s vysokým priepustným sekvenovaním, radi by sme sa s vami porozprávali. Či už ste výskumné laboratórium, biotechnologická spoločnosť alebo farmaceutická firma, môžeme vám poskytnúť správne produkty a podporu. Kontaktujte nás a začnite konverzáciu o vašich konkrétnych potrieb a o tom, ako naše DNA polymerázy môžu optimalizovať vaše postupy sekvenovania.
Odkazy
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Molekulárna biológia bunky. Garland Science.
- Brown, TA (2002). Genómy. Wiley - Liss.
- Metzker, ML (2010). Sekvenčné technológie - ďalšia generácia. Nature Reviews Genetics, 11 (1), 31 - 46.