Hej! Ako dodávateľ súprav na izotermálnu amplifikáciu RNA sa mi často pýtajú túto otázku: „Môže sa súprava izotermálnej amplifikácie RNA použiť na kvantitatívnu analýzu RNA?“ No, poďme sa do toho a rozoberte ho.
Po prvé, čo je izotermická amplifikácia RNA? Na rozdiel od dobre známych polymerázových reťazcových reakcií (PCR), ktorá potrebuje viac teplotných cyklov, sa pri konštantnej teplote vyskytuje izotermálna amplifikácia RNA. Je to dosť šikovná technológia, ktorá získava popularitu v posledných rokoch.
Jednou z hlavných výhod použitia súpravy izotermálnej zosilnenia RNA je jej jednoduchosť. Nepotrebujete luxusný termokycler so všetkými týmito teplotami - meniaci sa nastavenia. Vďaka tomu je prístupnejšia, najmä pre bod - testovanie starostlivosti alebo v zdrojoch - obmedzené nastavenia. Ale veľká otázka zostáva: dá sa použiť na kvantitatívnu analýzu?
Začnime tým, že sa pozrieme na základné princípy kvantitatívnej analýzy RNA. Stručne povedané, chceme presne vedieť, koľko špecifickej molekuly RNA je prítomná vo vzorke. To je rozhodujúce v mnohých oblastiach, napríklad virológia na meranie vírusovej záťaže alebo v štúdiách génovej expresie, aby sme pochopili, ako sa regulujú gény.
Tradičné metódy na kvantitatívnu analýzu RNA, ako napríklad reálny čas PCR (qPCR), boli zlatým štandardom. QPCR používa fluorescenčné farbivá alebo sondy na detekciu množstva amplifikovanej DNA (ktorá je spätne - transkribovaná z RNA) v reálnom čase. Cyklus, pri ktorom fluorescencia prechádza určitým prahom (hodnota CT), sa potom použije na výpočet počiatočného množstva RNA vo vzorke.
Teraz pre súpravy na izotermické amplifikačné súpravy RNA. Tieto súpravy zvyčajne fungujú pomocou enzýmov, ktoré môžu amplifikovať RNA pri konštantnej teplote. NapríkladMIRA RNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava BASIC - IIje jedným z našich výrobkov, ktorý využíva túto technológiu. Môže rýchlo zosilniť ciele RNA, ale môžeme ich použiť na ich kvantifikáciu?
Odpoveď je o niečo komplikovanejšia ako jednoduchý áno alebo nie. Na jednej strane existujú určité výzvy. Na rozdiel od QPCR, ktorý má studňu zavedenú metódu na kvantifikáciu na základe hodnoty CT, Izotermálna amplifikácia RNA nemá priamy ekvivalent. Kinetika amplifikácie v izotermálnych systémoch môže byť zložitejšia a faktory, ako sú počiatočné reakčné podmienky, aktivita enzýmov a dostupnosť substrátu, môžu mať väčší vplyv na mieru amplifikácie.
To však neznamená, že je to nemožné. Niektorí vedci prišli s kreatívnymi spôsobmi, ako urobiť izotermálnu amplifikáciu RNA vhodný na kvantitatívnu analýzu. Jedným z prístupov je použitie vnútorných štandardov. Rovnako ako v prípade QPCR môžete do vzorky pridať známe množstvo kontrolnej molekuly RNA. Porovnaním amplifikácie cieľovej RNA s amplifikáciou amplifikácie RNA môžete získať odhad množstva cieľovej RNA.
Ďalším spôsobom je použitie detekčných metód založených na fluorescencii v kombinácii s Izotermálnou amplifikáciou RNA. Napríklad niektoré z našich súprav, napríkladMIRA RNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava Nukleový kyselina Testovaný pásik, je možné modifikovať tak, aby začlenila fluorescenčné sondy. Meraním intenzity fluorescencie v priebehu času môžete monitorovať proces zosilnenia a potenciálne ho použiť na kvantifikáciu.
Hovorme tiež o výhodách použitia našich súprav na izotermickej amplifikácii RNA na kvantitatívnu analýzu v porovnaní s tradičnými metódami. Ako som už spomenul, jednoduchosť a rýchlosť sú obrovské plusy. S našimi súpravami môžete dosiahnuť výsledky v oveľa kratšom čase v porovnaní s QPCR, ktorý zvyčajne trvá hodinu alebo viac. Toto je obzvlášť dôležité v situáciách, keď je rýchla diagnostika rozhodujúca, napríklad počas vypuknutia infekčnej choroby.
Okrem toho sú naše súpravy veľmi špecifické. Sú navrhnuté tak, aby sa zamerali iba na záujmové sekvencie RNA, čím sa znižujú šance na falošné - pozitívne výsledky. Táto špecifickosť je nevyhnutná pre presnú kvantitatívnu analýzu, pretože sa chcete uistiť, že meríte iba RNA, o ktorú vás zaujíma.
Teraz sa dotknime niektorých praktických aspektov. Ak uvažujete o použití našich súprav na izotermickej amplifikácii RNA na kvantitatívnu analýzu, je potrebné mať na pamäti niekoľko vecí. Najprv musíte optimalizovať reakčné podmienky. To zahŕňa veci, ako je koncentrácia enzýmov, primérov a iných činidiel. Dobre optimalizovaná reakcia vám poskytne reprodukovateľnejšie výsledky, čo je kľúčom k presnému kvantifikácii.
Po druhé, musíte overiť svoju kvantitatívnu metódu. To znamená spustenie viacerých replikátov známych vzoriek a porovnanie výsledkov s referenčnou metódou, napríklad qPCR. Týmto spôsobom môžete stanoviť presnosť a presnosť svojej kvantitatívnej analýzy pomocou našich súprav na izotermálnu amplifikáciu RNA.
Máme tiež ďalší skvelý produkt,MIRA DNA izotermálna rýchla amplifikačná súprava základná. Aj keď je to pre amplifikáciu DNA, princípy kvantitatívnej analýzy môžu byť v niektorých ohľadoch podobné. Môže sa použiť v kombinácii s analýzou RNA v niektorých prípadoch, napríklad keď chcete študovať vzťah medzi hladinami DNA a RNA v bunke.
Záverom je, že zatiaľ čo súpravy izotermálnej amplifikácie RNA čelia určitým výzvam, pokiaľ ide o kvantitatívnu analýzu RNA, je možné so správnym prístupom. Naša spoločnosť sa zaväzuje poskytovať súpravy vysokej kvality a podporovať našich zákazníkov pri skúmaní potenciálu týchto technológií pre kvantitatívne aplikácie.
Ak máte záujem dozvedieť sa viac o našich súpravách na izotermálne zosilnenie RNA alebo chcete diskutovať o tom, ako sa dajú použiť pre vaše konkrétne potreby kvantitatívnej analýzy, radi by sme sa od vás dozvedeli. Stačí nás osloviť, aby sme začali konverzáciu o obstarávaní a o tom, ako môžeme spolupracovať pri splnení vašich výskumných cieľov.
Odkazy
- Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., & Hase, T. (2000). Izotermálna amplifikácia DNA sprostredkovaná slučkou. Nukleové kyseliny Research, 28 (12), E63 - E63.
- Gootenberg, JS, Abudayyeh, Oo, Lee, JW, Essletzbichler, P., Dy, A., Joung, J., ... & Zhang, F. (2018). Detekcia nukleových kyselín s CRISPR - CAS13A/C2C2. Science, 360 (6387), 439 - 444.